大豆中GmHIR1过表达增强对大豆疫霉根腐病的抗性

《Plants》：Overexpression of GmHIR1 in Soybean Enhances Phytophthora sojae Resistance

　　

疫霉根腐病是一种严重降低大豆产量与品质的主要病害。过敏诱导反应（HIR）蛋白在大豆对大豆疫霉（Phytophthora sojae，P. sojae）抗性中的作用尚不明确。本研究利用野生型W82、GmHIR1过表达系（OE1和OE2）以及CRISPR/Cas9敲除突变体（Q48和Q54）来鉴定GmHIR1的功能。GmHIR1在P. sojae侵染后被诱导表达。敲除突变体表现出更大的病斑、更高的病原菌生物量以及感染部位细胞死亡增加。相比之下，过表达系则表现出病斑减小、病原菌积累降低以及染色信号减弱。这些结果表明，GmHIR1正调控大豆对P. sojae的抗性。进一步的转录组学和蛋白质组学分析显示，GmHIR1过表达引起了感染诱导分子应答的广泛变化。差异调控的基因和蛋白质主要与Ca²⁺和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导、氧化应激反应、过氧化物酶活性以及苯丙烷和类黄酮代谢相关。总之，GmHIR1作为大豆对P. sojae抗性的正调控因子发挥作用。它可能通过与早期免疫应答、氧化还原稳态、程序性细胞死亡调控以及防御相关代谢过程的关联来增强抗性。本研究将GmHIR1鉴定为改善大豆对疫霉根腐病抗性的候选基因。

大豆（Glycine max）是全球最重要的油料和蛋白作物之一，但其生产受到多种生物胁迫的挑战，其中由土壤传播的卵菌——大豆疫霉（Phytophthora sojae，P. sojae）引起的疫霉根腐病是破坏性最强的病害之一。该病原菌可侵染大豆整个生育期，导致根腐、茎部褐变、叶片萎蔫甚至死亡，且具有高致病型多样性，一旦在田间定殖便难以根除，严重威胁大豆可持续生产。因此，培育抗病品种是最经济有效的防治策略，而这依赖于抗病基因的鉴定与利用。植物免疫包括模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI），其中过敏反应（HR）是一种局部程序性细胞死亡（PCD），可限制病原菌扩展。过敏诱导反应（HIR）蛋白是一类膜相关蛋白，在植物免疫中具有重要调控作用，但大豆中HIR家族成员的功能机制尚不清楚。为阐明GmHIR1（Glyma.05G029800）在大豆抗P. sojae中的作用，研究人员开展了本研究。该研究利用野生型Williams 82（W82）、GmHIR1过表达系（OE1和OE2）以及CRISPR/Cas9敲除突变体（Q48和Q54），通过表达模式分析、根接种抗性鉴定、台盼蓝染色以及转录组与蛋白质组联合分析，证实GmHIR1正调控大豆对P. sojae的抗性，并揭示了其可能涉及的分子机制。该研究鉴定出GmHIR1可作为改善大豆疫霉根腐病抗性的候选基因，论文发表于《Plants》。

关键技术方法简要概括：研究人员以大豆品种Williams 82（W82）为野生型背景，通过农杆菌介导的转化构建了GmHIR1过表达系（OE1、OE2）和CRISPR/Cas9敲除突变体（Q48、Q54）。采用P. sojae菌株接种于V1期大豆幼苗下胚轴，进行抗性鉴定。利用RT-qPCR分析表达模式及病原菌生物量，台盼蓝染色评估细胞死亡。选取OE1和W82，在接种后0小时和48小时收集根组织，进行RNA-seq（DNBSEQ-T7平台）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学分析，鉴定差异表达基因（DEG）和差异表达蛋白（DEP），并进行GO和KEGG富集分析。

研究结果：
2.1 表达模式分析与转基因大豆植株创制：通过RT-qPCR检测，GmHIR1在P. sojae接种后逐渐上调，6小时显著升高，12–24小时维持较高水平，36–48小时略有下降但仍高于接种前。研究人员构建了35S启动子驱动的GmHIR1过表达载体（pTF101-GmHIR1），获得OE1和OE2两个独立过表达系；同时利用CRISPR/Cas9系统获得Q48（2 bp缺失）和Q54（4 bp缺失）两个独立敲除突变体。RT-qPCR确认OE1和OE2中GmHIR1表达显著升高，Q48和Q54中表达显著降低。
2.2 GmHIR1正调控大豆对P. sojae的抗性：接种48小时后，过表达系（OE1、OE2）病斑面积显著小于野生型，而敲除突变体（Q48、Q54）病斑显著增大。RT-qPCR测定病原菌生物量，过表达系中病原菌积累显著减少，敲除突变体则显著增加。台盼蓝染色显示，敲除突变体感染部位染色更广泛，过表达系染色更弱；ImageJ定量分析证实，敲除突变体染色面积比例显著增加，过表达系显著减少。这些结果表明GmHIR1缺失导致感染相关细胞死亡积累增加，而过表达则限制过度细胞死亡，GmHIR1作为正调控因子发挥作用。
2.3 GmHIR1过表达显著改变大豆对P. sojae感染的转录响应：由于敲除突变体根腐烂严重，选取OE1进行后续组学分析。RNA-seq分析显示，接种48小时后，W82中鉴定出2193个DEG（1535上调、658下调），OE1中鉴定出7824个DEG（4086上调、3738下调）。OE1和W82之间在48小时比较得到2213个上调、2721个下调DEG。提取OE1特异性DEG进行GO富集，主要涉及序列特异性DNA结合、钙离子结合、铜离子结合、过氧化物酶活性、抗氧化活性等分子功能，以及光系统、氧化还原酶复合物等细胞组分。KEGG富集显示淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷生物合成、MAPK信号通路、ABC转运蛋白等显著富集。
2.4 GmHIR1过表达改变大豆对P. sojae感染的蛋白质组响应：蛋白质组学分析，OE1和W82在接种后48小时，OE1中DEP数量多于W82。OE1特异性DEP（401个）的GO富集显示生物过程涉及氧化应激应答、多糖分解过程，分子功能涉及金属离子结合、过氧化物酶活性、聚半乳糖醛酸酶活性等。KEGG富集显示吞噬体、氧化磷酸化、马达蛋白、亚油酸代谢、苯丙烷生物合成等通路。
2.5 转录组与蛋白质组整合分析揭示GmHIR1过表达系中防御代谢的协同变化：整合分析发现38个分子在mRNA和蛋白质水平均差异表达。九象限图显示部分分子趋势一致，部分不一致，提示存在转录后和翻译后调控。GO富集显示这些共差异分子涉及氧化应激应答、金属离子转运、海藻糖生物合成、多糖分解过程、脂质代谢过程等，分子功能涉及内肽酶抑制剂活性、过氧化物酶活性、铜离子结合等。KEGG富集显示苯丙烷生物合成、光合作用天线蛋白、二萜生物合成、类黄酮生物合成等通路。

讨论部分总结：研究人员指出，GmHIR1在大豆对P. sojae抗性中作为正调控因子，其诱导表达与抗性表型一致，与拟南芥、水稻、烟草等物种中HIR基因的功能保守性相符。在过敏反应与程序性细胞死亡调控方面，敲除突变体中台盼蓝染色增强伴随病斑增大和病原菌积累增加，表明细胞死亡失控可能促进病害发展，而过表达系维持了受控的局部细胞死亡。GmHIR1过表达还与Ca²⁺/MAPK相关防御应答增强有关，转录组富集到钙离子结合和MAPK信号通路，与先前报道的GmWAK1、GmMKK4-GmMPK6-GmERF113模块增强抗性一致。此外，整合组学分析显示GmHIR1过表达与苯丙烷、类黄酮、异黄酮代谢途径变化相关，这些途径参与木质素、类黄酮及大豆植保素（如glyceollins）的合成，与GmDIR22、GmCHI1A等已知抗性基因功能一致。研究结论：GmHIR1作为大豆对P. sojae抗性的正调控因子，通过参与早期免疫应答、氧化还原稳态、程序性细胞死亡调控以及防御相关代谢过程增强抗性，本研究将GmHIR1鉴定为改善大豆对疫霉根腐病抗性的候选基因。