一种富含核糖体蛋白的肿瘤细胞上清液，可作为促进巨噬细胞极化的强效诱导剂，用于协同抗肿瘤化疗

《Biomaterials》：A ribosomal protein-rich tumor cell supernatant as a potent inducer of macrophage polarization for synergistic antitumor chemotherapy

　　

摘要

促进肿瘤相关巨噬细胞呈现M1极化状态是一种颇具前景的策略，可通过改变免疫抑制性的肿瘤微环境来助力肿瘤治疗。在此，我们基于光动力治疗策略制备的肿瘤细胞上清液，开发出一种新的肿瘤治疗方法。有趣的是，与通过冻融处理和超声处理获得的两种常见细胞裂解物相比，该肿瘤细胞上清液更能有效促使巨噬细胞呈现M1极化状态，而这种作用很可能源于其较高的核糖体蛋白含量（如40S核糖体蛋白S3），而非因光动力治疗引发的肿瘤细胞免疫原性死亡所释放的典型损伤相关分子模式（如钙网蛋白和高迁移率族盒1）。随后，我们利用该肿瘤细胞上清液制备出了负载化疗药物的水凝胶（称为药物@肿瘤细胞上清液水凝胶；药物包括多柔比星、顺铂或5-氟尿嘧啶）。将此类水凝胶注入肿瘤组织后，能够有效促进肿瘤相关巨噬细胞呈现M1极化状态，扭转免疫抑制性的肿瘤微环境，从而显著抑制肿瘤生长。因此，这类肿瘤细胞上清液有望通过诱导肿瘤相关巨噬细胞呈现M1极化状态来提升肿瘤治疗效果，同时也凸显了光动力治疗处理的肿瘤细胞所释放的核糖体蛋白所具有的免疫刺激作用。

引言

肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分。在肿瘤进展过程中，M2型肿瘤相关巨噬细胞会促进肿瘤细胞的增殖与侵袭，增强肿瘤干细胞的活性，还会诱导血管生成，进而推动肿瘤的进展与转移。此外，这类巨噬细胞还会分泌抗炎细胞因子，抑制细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞的活性，从而帮助肿瘤实现免疫逃逸[1]，[2]，[3]，[4]，[5]，[6]，[7]，[8]。同时，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤治疗抵抗中也起着关键作用[1]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]。例如，Shi等人发现，M2型肿瘤相关巨噬细胞可通过依赖己糖胺生物合成途径的O-连接β-N-乙酰葡萄糖胺修饰作用促进肿瘤转移和化疗耐药性，而这一过程得益于肿瘤相关巨噬细胞对葡萄糖的吸收增加[10]。相反，M1型肿瘤相关巨噬细胞则可通过激活抗肿瘤免疫反应以及介导肿瘤细胞吞噬作用来抑制肿瘤生长[18]，[19]，[20]，[21]。因此，将M2型肿瘤相关巨噬细胞转化为M1型可能是提高肿瘤治疗敏感性、扭转免疫抑制性肿瘤微环境、提升抗肿瘤治疗效果的有效策略[4]，[10]，[16]，[17]，[22]，[23]，[24]，[25]，[26]。比如，Jiang等人设计了基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的微粒，该微粒负载有多柔比星和瑞西莫德，经实验验证，这类微粒可通过杀死多形性胶质母细胞瘤细胞并促使肿瘤相关巨噬细胞呈现M1极化状态，从而重新激活肿瘤的对治疗的响应[23]。另外，Qin等人还研发了一种由PLGA、聚烯丙胺盐酸盐、MER原癌基因酪氨酸激酶抑制剂UNC2025以及酵母来源的β-葡聚糖组成的纳米混合系统，他们将该系统与紫杉醇结合使用，实现了肿瘤相关巨噬细胞的M1极化以及有效的肿瘤化学免疫联合治疗[24]。

近年来，以肿瘤或肿瘤细胞衍生的成分为基础的产品被广泛用于激活抗肿瘤免疫反应[27]，[28]，[29]，[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，[35]，[36]，[37]，[38]，[39]。与R848这类小分子激动剂以及β-葡聚糖这类微生物衍生产品相比，肿瘤衍生产品具有更强的引发强烈免疫反应的能力，且生物相容性优异[29]，[40]，[41]，[42]。此外，许多肿瘤衍生产品的生产流程较为简单，成本也不高。因此，这类产品更适合作为个性化的抗肿瘤免疫刺激剂，用以提升抗肿瘤治疗效果。

光动力治疗是通过光激活的光敏剂产生活性氧物种，进而导致肿瘤细胞发生免疫原性死亡，促使肿瘤细胞释放损伤相关分子模式，从而引发抗肿瘤免疫反应[43]，[44]，[45]，[46]，[47]，[48]，[49]，[50]，[51]，[52]。Yang等人通过体外光动力治疗策略制备了肿瘤细胞衍生疫苗，并证明这类疫苗能够有效诱导针对肿瘤的系统性免疫反应[50]。因此，光动力治疗为制备用于激发抗肿瘤免疫反应的肿瘤细胞衍生产品提供了一种独特的方法。不过，目前大多数这类肿瘤细胞衍生产品都是用于激活树突状细胞所引发的系统性免疫反应，而它们对肿瘤部位巨噬细胞的影响却鲜有研究。此外，大多数研究仅将这些产品的免疫刺激作用归因于钙网蛋白和高迁移率族盒1这类已被广泛研究的损伤相关分子模式，而光动力治疗处理后的肿瘤细胞所释放的其他蛋白质在免疫刺激中的作用仍大多未被重视。

在此，我们利用光动力治疗处理后具有促进肿瘤相关巨噬细胞呈现M1极化能力的肿瘤细胞上清液，制备出了基于水凝胶的药物载体。首先用氯丁酚e6和660纳米激光处理肿瘤细胞，随后收集肿瘤细胞上清液，用来制备负载化疗药物的水凝胶（称为药物@肿瘤细胞上清液水凝胶；药物包括多柔比星盐酸盐、顺铂或5-氟尿嘧啶），并将其注入肿瘤组织内使用（见图1a）。与不添加肿瘤细胞上清液的载药水凝胶相比，药物@肿瘤细胞上清液水凝胶能显著提升肿瘤相关巨噬细胞的M1极化程度，扭转免疫抑制性的肿瘤微环境，进而协同提升抗肿瘤治疗效果（见图1b）。此外，我们还发现，肿瘤细胞上清液诱导巨噬细胞呈现M1极化状态的能力，明显强于另外两种常用的细胞裂解物，即通过超声处理获得的细胞裂解物和通过冻融处理获得的细胞裂解物（分别称为“超声处理样本”和“冻融处理样本”）（见图1c）。进一步研究表明，肿瘤细胞上清液中有多种核糖体蛋白表达过量，其中一种过表达的核糖体蛋白——40S核糖体蛋白S3被证实具有免疫刺激作用。相反，钙网蛋白和高迁移率族盒1这两种典型的损伤相关分子模式在肿瘤细胞上清液中并未出现过度表达。因此，我们推测，肿瘤细胞上清液诱导巨噬细胞呈现M1极化状态的作用，很可能源于核糖体蛋白，而非钙网蛋白或高迁移率族盒1。这项研究不仅构建了一种高效的基于水凝胶的载体平台，可用于实现抗肿瘤化学免疫联合治疗，还凸显了核糖体蛋白作为新型免疫刺激分子在提升肿瘤免疫治疗效果方面的潜力。据我们所知，这是首次揭示光动力治疗处理后的肿瘤细胞所释放的核糖体蛋白具有强大的抗癌免疫刺激作用。

章节节选

肿瘤细胞上清液的制备及体外免疫刺激作用

为了获得肿瘤细胞上清液，首先将4T1细胞与含有氯丁酚e6的细胞培养基共同培养。如图S1a所示的流式细胞术检测结果表明，培养4小时后，细胞对氯丁酚e6的摄取量达到了较高水平。之后，将细胞培养基替换为磷酸盐缓冲液，再让细胞暴露在660纳米激光下（强度为5毫瓦/平方厘米，照射时间为3分钟），随后进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑盐染色试验。试验所得结果如下

结论

在本研究中，我们开发了一种基于光动力治疗的策略来制备肿瘤细胞上清液，该上清液具有很强的促使巨噬细胞呈现M1极化状态的能力。随后，我们将该肿瘤细胞上清液负载到由氧化羟基丙烯酸和羧甲基纤维素制成的可注射水凝胶中，形成了肿瘤细胞上清液水凝胶，这类水凝胶还能够包裹多柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶等常见的化疗药物。重要的是，我们发现肿瘤细胞上清液诱导巨噬细胞呈现M1极化状态的能力，要强于另外两种常用的细胞

化学品与材料

氯丁酚e6购自北京J&K Scientific Ltd.公司；氧化羟基丙烯酸和羧甲基纤维素购自上海Macklin Biochemical Co., Ltd.公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑盐染色试剂购自上海Aladdin Chemistry Co., Ltd.公司；巨噬细胞刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4购自美国Rocky Hill的Pepro Tech Inc.公司；抗RPS3抗体（编号11990-1-AP）以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（编号SA00001-2）

CRediT作者贡献说明

王志豪：研究工作开展、数据整理。 吴福根：论文撰写与修改、实验验证、研究指导、资源提供、项目管理、方法设计、资金获取、研究构思。 张新平：论文撰写与修改、方法设计、研究工作开展、数据分析、数据整理。 胡鹏程：论文撰写与修改、资金获取、数据整理。 李子恒：论文撰写与修改、初稿撰写、方法设计、研究工作开展、数据分析

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性声明

本研究的相关数据，可在合理请求下向相应作者获取。

利益冲突声明

? 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了非传染性疾病国家科技重大专项（编号2025ZD0545600）、广西区域高频肿瘤早期预防与治疗重点实验室（编号GKE-KF202305）、广西科学技术计划项目（编号AD25069077）、国家自然科学基金（编号82372127）、东南大学与江苏省医院开放研究基金（编号2024-M01），以及中国博士后科研资助计划的支持

Zi-Heng Li|Xinping Zhang|Zihao Wang|Qi Gong|Li Ou|Yong-Xi Zhou|Rong Zhou|Yaolong An|Yi Luo|Huiying Lai|Ke-Fei Xu|Pengcheng Hu|Fu-Gen Wu

中国南京211189，东南大学生物科学与医学工程学院，数字医学工程国家重点实验室，生物材料与器械江苏省重点实验室