靶向线粒体的纳米增强剂驱动自放大NAD+反馈循环，重塑间充质干细胞球体的代谢机制以加速骨再生

《Biomaterials》：Mitochondrial-Targeted Nano-Enhancer Driving a Self-Amplifying NAD+ Feedback Loop to Reprogram MSC Spheroids Metabolism for Accelerated Bone Regeneration

　　

摘要

线粒体氧化磷酸化在决定间充质干细胞的功能命运中起着关键作用。然而，目前仍缺乏有效策略来精确调控三维MSC球体中的线粒体生物能量代谢，从而改善骨骼修复效果。在本研究中，我们开发了一种靶向线粒体的纳米增强剂（BP@PDA-TPP/Q），通过重新编程这些细胞的能量代谢途径，提升MSC球体在骨骼再生方面的治疗潜力。该纳米增强剂以黑磷纳米片作为可降解核心，聚多巴胺作为稳定涂层，用于连接配体并负载PQQ；三苯基膦则引导纳米载体进入线粒体，而送入的吡咯喹啉醌可作为线粒体内的氧化还原辅因子，推动自我放大的NAD⁺反馈循环。在此过程中，局部的PQQ辅因子能够激活SIRT3/PGC-1α通路，进而上调烟酰胺磷酸核糖转移酶和线粒体转运蛋白SLC25A51的表达，这两种蛋白共同加速NAD⁺的合成及其在线粒体内的导入，从而持续维持并增加线粒体内的NAD⁺含量。这样一来，MSC球体的代谢模式就从糖酵解转向了氧化磷酸化。这种代谢重编程显著提升了球体在体外时的成骨能力，并在大鼠颅骨缺损模型中促进了有效的骨骼再生。我们的研究为骨骼再生提供了一种新的纳米疗法，也为通过靶向代谢调控推进干细胞治疗奠定了新的理论基础。

引言

由创伤、肿瘤切除、感染或先天性疾病引起的较大面积骨缺损很难通过自然方式愈合，通常需要采取重建手术[1]、[2]。虽然自体移植和异体移植被广泛使用，但由于供体短缺、供体部位出现并发症以及整合效果不稳定等问题，其疗效存在局限，因此人们一直在探索基于细胞和生物材料支撑的骨组织工程方法[3]。

间充质干细胞因其可在体外扩增、具有免疫调节功能，且在适当信号作用下可分化为成骨细胞系，而被视为骨骼再生的理想种子细胞[4]、[5]。近年来，三维MSC球体作为一种替代传统单层培养的方法逐渐受到关注，因为细胞聚集能够恢复细胞间及细胞与基质之间的相互作用，进而提高细胞的耐受性及与组织修复相关的分泌功能[6]、[7]。不过，这种复杂的结构也会导致氧气和营养物质分布不均，形成浓度梯度，使得不同区域的代谢状态存在差异，这可能会影响细胞的存活及分化进程——尤其是在需要大量能量的成骨过程中[8]。

线粒体氧化磷酸化在决定MSC的命运方面起着重要作用[9]。MSC的成骨分化是一个耗能极大的过程，在此过程中，细胞的代谢模式会从以糖酵解为主转变为以氧化磷酸化为主[10]。在三维球体培养环境中，由于空间限制，这种代谢依赖性可能会进一步加剧，受限的微环境会给线粒体带来压力，破坏其结构与氧化还原平衡。从机制上来看，线粒体氧化磷酸化与线粒体内NAD⁺池的大小及其氧化还原状态密切相关[11]、[12]。线粒体内的NAD⁺/NADH比例会影响电子在呼吸链中的流动，进而影响活性氧的处理；而依赖NAD⁺的酶类，包括线粒体苏尔托因，可调控与代谢活动相关的蛋白质乙酰化状态[13]、[14]。尤其是苏尔托因3，它与线粒体质量控制及氧化代谢有关，它与PGC-1α等线粒体生物发生调控因子的相互作用，为通过调控NAD⁺的供应来重新编程MSC的生物能量代谢提供了理论依据[15]、[16]、[17]。

在哺乳动物细胞中，NAMPT催化NAD⁺回收途径中的限速反应，因此直接影响细胞内的NAD⁺水平。值得注意的是，NAMPT的活性与MSC的分化方向密切相关：NAMPT信号减弱会导致成骨能力下降、脂肪生成倾向增强，而保持NAD⁺相关信号的活跃则有助于促进成骨效应[18]。不过，NAMPT主要调控的是细胞质和细胞核中的NAD⁺池，因此如何将NAD⁺高效输送到线粒体以支持三维球体中的氧化磷酸化过程，仍然是一个未解之谜。最近的研究发现，SLC25A51是一种关键的转运蛋白，它负责将完整的NAD⁺转运穿过哺乳动物细胞的内膜进入线粒体[19]、[20]、[21]。如果该蛋白的功能受损，就会导致线粒体内的NAD⁺选择性减少，进而影响细胞的呼吸功能，这表明线粒体内NAD⁺的转运在氧化代谢过程中起着至关重要的作用[22]。总体而言，由NAMPT驱动的NAD⁺合成以及依赖SLC25A51的线粒体NAD⁺导入共同构成了一套双重调控系统，理论上可用于维持线粒体内的NAD⁺水平，从而促进氧化磷酸化。不过，目前尚未有研究系统地探讨过在MSC球体中使用这一机制来增强成骨功能。

黑磷纳米片是一种可生物降解的二维纳米材料，可通过特殊设计用于生物医学应用，且会分解为含磷酸的物质，这类物质可能与骨骼修复过程中的矿化过程相契合[23]、[24]。我们之前的研究主要聚焦于功能性MSC球体，利用黑磷或氧化石墨烯来输送白细胞介素-4、地塞米松、碳纳米管等其他物质，以此增强细胞的成骨及免疫反应，进而调节骨骼修复过程[25]、[26]、[27]。因此，我们开始考虑将代谢调控作为另一种辅助策略。吡咯喹啉醌是一种具有氧化还原活性的邻醌类物质，它能保护线粒体免受氧化应激的损伤，同时还能促进与线粒体生物发生相关的信号传导[28]、[29]。这些特性使得吡咯喹啉醌成为调控线粒体氧化还原代谢的理想候选物，不过由于其稳定性问题以及难以高效地输送到细胞内，尤其是线粒体内部——而正是在线粒体中，它的作用可能最为显著，因此实际应用仍面临诸多限制。

在本研究中，我们开发了一种靶向线粒体的纳米平台（BP@PDA-TPP/Q），旨在提高PQQ在MSC球体中的线粒体摄取效率。PDA涂层不仅能增强该纳米材料的胶体稳定性，还为后续的功能化处理提供了反应位点；而TPP阳离子则可以利用线粒体膜的电位差异，帮助纳米载体积累在线粒体中。我们发现，定位于线粒体内的PQQ能够调节线粒体内的NAD⁺/NADH氧化还原平衡，进而增强依赖于SIRT3-PGC-1α通路的线粒体功能。此外，BP@PDA-TPP/Q还能通过NAMPT介导的途径促进NAD⁺的补充，同时借助SLC25A51促进线粒体对NAD⁺的吸收，因此在空间和营养物质都较为受限的球体环境中，氧化磷酸化反应能够得到更持久的强化。基于此，我们进一步研究了这种代谢重编程是否能在体外提升MSC的成骨分化能力，以及在体内改善骨缺损的修复效果。如方案1所示，这些研究结果有望证明BP@PDA-TPP/Q是一种有效的代谢纳米调控剂，可用于修复骨缺损，同时也凸显了靶向线粒体能量代谢的治疗价值，为未来的生物能量干预策略提供了新的思路。

章节节选

BP@PDA-TPP/Q的制备与表征

这种靶向线粒体的纳米材料BP@PDA-TPP/Q是通过一套系统的组装工艺制得的，起始原料为块状黑磷（见图1a）。简而言之，首先将块状黑磷晶体剥离成二维黑磷纳米片，然后在这些纳米片表面涂覆一层PDA，接着通过碳二亚胺介导的反应，将一种靶向线粒体的TPP衍生物连接到纳米片上，最后再负载PQQ。如图S1a所示，黑磷、BP@PDA、BP@PDA-TPP以及BP@PDA-TPP/Q呈现出灰褐色

结论

在本研究中，我们发现一种名为BP4@PDA-TPP/Q的靶向线粒体纳米材料，它能够有效调控MSC球体中的生物能量代谢及成骨能力。得益于黑磷纳米片较高的负载能力和良好的细胞内输送性能，经过TPP功能化处理后，PQQ能够优先被输送到线粒体中。线粒体内的PQQ能够重新平衡氧化还原平衡，提高线粒体内的NAD⁺/NADH比例，同时还能激活SIRT3/PGC-1α通路。这一作用

黑磷的制备及黑磷纳米片的合成

黑磷纳米片是通过液相剥离法制备的。具体来说，首先将块状黑磷晶体分散在无水N-甲基-2-吡咯烷酮中，然后在氩气环境下进行脉冲超声处理，以避免材料发生氧化降解。处理后的混合物经过逐级离心，去除未被剥离的块状物质，最终得到富含黑磷纳米片的悬浮液。随后收集含有黑磷纳米片的上清液，立即用于后续的表面处理

CRediT作者贡献说明

Wenkai Li：数据整理。Areonna C. Schreiber：方法设计。Hailong Li：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、数据整理。Xifeng Liu：正式分析。Kaelyn L. Gasvoda：正式分析。Sungjo Park：方法设计。Abdelrahman M. Hamouda：方法设计。Lichun Lu：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、资金申请。Andre Terzic：方法设计。Benjamin D. Elder：正式分析

数据可用性声明

所有支持本研究结果的数据均保存在本文中，如有合理需求，可予以提供。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在任何可能影响本研究结果的竞争性财务利益或个人关系。

利益冲突声明

? 所有作者均声明，他们不存在任何已知的、可能影响本论文研究结果的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院的R01 AR075037号资助。微型CT扫描的部分费用由梅奥诊所的X射线成像中心承担。S.P.和A.T.则获得了万豪家族基金会的资助。

Hailong Li|Xifeng Liu|Wenkai Li|Areonna C. Schreiber|Sungjo Park|Abdelrahman M. Hamouda|Kaelyn L. Gasvoda|Andre Terzic|Benjamin D. Elder|Lichun Lu

美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所生理学与生物医学工程系，邮编55905