《Biomaterials》：Synthetic Polypeptide Adjuvant-Antibiotic Combination Eradicates Polymicrobial Assemblies, Dormant Bacteria and Bacterial Biofilm
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本研究探索了聚（D-肽）[poly(D-peptide), D-PP]与不同类别抗生素联用以应对多重耐药（multidrug-resistant, MDR）革兰阴性“超级细菌”的效力，包括其成熟生物被膜（biofilm）、多菌种聚集体（polymicrobia
本研究探索了聚（D-肽）[poly(D-peptide), D-PP]与不同类别抗生素联用以应对多重耐药（multidrug-resistant, MDR）革兰阴性“超级细菌”的效力，包括其成熟生物被膜（biofilm）、多菌种聚集体（polymicrobial assemblies）及休眠亚群等复杂且具有挑战性的靶标。该多肽佐剂表现出显著的抗生素增效作用，使抗生素对处于浮游态（planktonic stage）的革兰阴性病原体产生中等至快速的杀菌活性。该佐剂及其联合方案还可恢复休眠细菌亚群对药物的敏感性。在多菌种环境中，这些联合方案能够同时降低革兰阴性和革兰阳性菌种负荷，而单独使用抗生素则难以实现。重要的是，其中一个优势联合方案，即D-PP-利福平（rifampicin, RIF），对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物被膜表现出中等程度的清除作用。转录组学（transcriptomics）分析表明，差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）涉及膜完整性、应激反应和转运系统。结合研究人员先前的机制研究结果，进一步证实该佐剂可引发细菌膜扰动。此类扰动促进了抗生素在微生物细胞内的积聚。此外，与多黏菌素B（polymyxin-B）不同，该多肽可降低细菌对多西环素（doxycycline, DOX）和利福平（RIF）产生耐药性的趋势。综上所述，这些结果表明，膜活性多肽佐剂能够在多种细菌生理状态和环境中增强抗生素疗效，为对抗持续性感染和多重耐药性感染提供了一种有前景的策略。
本文发表于《Biomaterials》，聚焦于抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）与生物被膜相关感染这一交叉难题。当前临床抗感染治疗面临三重障碍：其一，革兰阴性多重耐药菌外膜通透性低、外排系统活跃，导致多类传统抗生素疗效显著下降；其二，成熟生物被膜由胞外聚合物基质（extracellular polymeric substances, EPS）构成致密屏障，限制药物扩散并维持细菌异质性；其三，感染灶中常存在代谢休眠或缓慢生长的耐受亚群，以及由革兰阳性菌与革兰阴性菌组成的多菌种聚集体，这些复杂微环境均会显著削弱常规抗生素和传统联合方案的杀菌效果。因此，开发能够在不同细菌生理状态下普遍增强抗生素活性的非抗生素佐剂，具有重要转化价值。
研究人员基于先前构建的AMP模拟（antimicrobial peptide-mimicking，抗菌肽模拟）多肽体系，选取聚（D-肽）D-PP作为代表性膜活性佐剂，系统评估其与不同类别抗生素联用后在复杂感染模型中的表现。研究不仅考察了其对浮游细菌的快速杀菌能力，还进一步拓展至静止期休眠细胞、双菌种共培养体系以及成熟铜绿假单胞菌生物被膜模型，并结合转录组学分析佐证其膜扰动和转运调控机制。同时，研究通过连续传代实验评价该体系诱导耐药发展的倾向，从而综合判断其长期应用潜力。
主要技术方法方面，作者采用棋盘稀释法筛选代表性D-PP-抗生素组合，进行浮游菌与静止期细菌杀菌动力学测定、菌液浊度观察和菌落形成单位（CFU）计数；建立MRSA与铜绿假单胞菌双菌种共培养模型及72 h成熟铜绿假单胞菌生物被膜模型，结合共聚焦荧光显微镜评估杀菌和生物被膜破坏效果；通过14代连续传代测定最低抑菌浓度（MIC）变化评价耐药演化；并对E. coli ATCC BAA-2471与K. pneumoniae ATCC BAA-2473进行RNA-seq转录组测序分析差异表达基因。文中所用菌株均购自ATCC。
在研究结果方面，论文首先以“Diverse antibiotic potentiation by polypeptide adjuvants”为题，说明D-PP及外消旋对照多肽此前已被证实可使四环素类、安萨霉素类、大环内酯类、头孢菌素类和单环β-内酰胺类等多类抗生素对MDR革兰阴性菌的活性提升4–128倍。基于这一基础，本文选择D-PP与氨曲南（aztreonam, ATM）、红霉素（erythromycin, ERY）、多西环素（DOX）和利福平（RIF）等组合用于后续复杂模型验证。安全性结果显示，D-PP与DL-PP在1024 μg/mL下几乎不引起红细胞裂解，对HEK293细胞在32 μg/mL以内维持接近100%存活率，提示4–32 μg/mL为后续抗菌评估的相对安全范围。
在“Bactericidal kinetics of polypeptide adjuvant-antibiotic combinations”部分，研究人员通过时间杀菌曲线、浊度观察和固体平板复种三种方式共同确认联用方案的杀菌性质。D-PP（16 μg/mL）联合ATM（2或4 μg/mL）可在2 h内使浮游态鲍曼不动杆菌（A. baumannii）菌量下降约4.8-log，并在较高ATM条件下达到无可检菌落。D-PP（32 μg/mL）联合DOX（2或4 μg/mL）可在24 h内完全杀灭MDR肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae），细菌负荷下降约6-log。D-PP（32 μg/mL）联合ERY（8或16 μg/mL）则可在4 h内清除MDR E. coli，下降约6-log。值得注意的是，DOX和ERY原本多属于抑菌性药物，但与D-PP联用后转化为明确杀菌性方案，表明膜活性佐剂能够显著改变药效学结局。
在“Polypeptide adjuvant-antibiotic combinations against dormant bacteria”部分，作者聚焦于静止期休眠亚群。对E. coli而言，D-PP（16 μg/mL）联合ERY（16或32 μg/mL）在24 h分别产生约2-log和3.3-log杀灭效果。对K. pneumoniae，D-PP（32 μg/mL）联合DOX（2或4 μg/mL）在24 h实现约6.6-log下降并达到不可检出；且在该无营养缓冲条件下，D-PP单药本身即表现出较强抗静止期活性。对A. baumannii，D-PP（16 μg/mL）单药及其与ATM联用均可在2 h内快速杀灭静止期细胞。该部分结果表明，在实验设定下，联合方案对休眠细胞的清除能力在很大程度上由D-PP驱动，但总体上确实克服了传统抗生素对代谢不活跃细胞作用不足的关键局限。
在“Polypeptide adjuvant-antibiotic combinations against microbial co-assemblies”部分，研究人员建立了包含MRSA与铜绿假单胞菌的双菌种体系，以模拟多菌种感染环境中的增耐受现象。对于MRSA 44与P. aeruginosa ATCC BAA 2108共培养体系，D-PP（4 μg/mL）联合DOX（2 μg/mL）在12 h内使MRSA下降约5.4-log，同时使铜绿假单胞菌下降约2-log；而相同剂量下单药处理效果有限，万古霉素亦无法彻底清除共培养中的MRSA。对于另一种MRSA与P. aeruginosa ATCC 27853共培养体系，D-PP（16 μg/mL）联合夫西地酸（fusidic acid, FA）（4 μg/mL）可使MRSA完全清除，并使铜绿假单胞菌下降约2.7-log。作者据此指出，多菌种聚集体中的菌间互作会显著削弱抗菌效应，但D-PP及其联用方案仍可在一定程度上实现对革兰阳性和革兰阴性成员的同步打击，优于单独抗生素处理。
在“Efficacy of polypeptide adjuvant-antibiotic combination against mature biofilm”部分，作者选取D-PP-RIF组合考察其对72 h成熟铜绿假单胞菌生物被膜的作用。D-PP（16 μg/mL）联合RIF（4 μg/mL）可使生物被膜内细菌负荷下降约1.1-log，而提高D-PP、降低RIF的另一配比产生相近效果；多黏菌素B也仅表现出约1.3-log下降。单药D-PP或RIF对生物被膜相关细菌几乎无效。共聚焦显微镜进一步显示，联合处理后生物被膜厚度由对照组约6 μm降至约4 μm，红色荧光信号增加，提示膜受损细胞比例上升。该结果支持D-PP兼具基质相互作用和膜扰动效应，可有限度促进药物穿透并造成中等程度的生物被膜清除。
在“Bacterial resistance development against polypeptide adjuvant-antibiotic combination”部分，作者采用14代连续传代法比较D-PP联合方案与多黏菌素B的耐药发展趋势。在P. aeruginosa中，含D-PP（4 μg/mL）的DOX初始MIC为2 μg/mL，连续传代后仅出现有限度升高，至第14代总体维持在约2倍水平；D-PP单药MIC仅增加2倍。相比之下，多黏菌素B至第7天即升高256倍。在K. pneumoniae中，含D-PP（16 μg/mL）的RIF初始MIC为8 μg/mL，传代后呈阶梯式升高，较DOX体系更易发生耐药漂移，但仍明显低于多黏菌素B超过8000倍的剧烈升高。结果说明，D-PP联合方案虽不能完全阻断耐药演化，但可显著延缓耐药发展。
在“Transcriptomic Insights into membrane perturbation and transport modulation by polypeptide”部分，研究人员对E. coli和K. pneumoniae经D-PP（8与16 μg/mL）处理6 h后的转录响应进行分析。E. coli中，编码内膜相关蛋白的YaiY、外膜蛋白OmpX以及与ATP依赖性外排相关的YbhF上调，提示膜稳定性、通透性和应激适应发生改变。K. pneumoniae中，包膜应激反应蛋白PspG上调，而核糖摄取转运蛋白RbsA、甘油-3-磷酸转运相关UgpC及二肽转运相关DppC等ABC转运系统组分下调。结合既往机制研究，作者认为D-PP可同时扰动内外膜并调节摄取/外排通路，从而促进抗生素胞内积聚，尤其有利于克服因低内流和高外排导致的耐药。
讨论部分总体强调，本研究的创新之处不在于单纯证明多肽具备抑菌活性，而在于系统展示了膜活性合成多肽作为抗生素佐剂在多种困难感染生态位中的适用性。文章表明，D-PP所导致的轻度膜失稳可为多类传统或边缘化抗生素创造重新发挥作用的条件；这种增敏效应不仅体现在浮游菌，也延伸至休眠细胞、多菌种聚集体和成熟生物被膜等临床棘手状态。同时，联合策略相较于多黏菌素B显示出更低的耐药诱导倾向，提示其在疗效持续性方面具有优势。当然，作者也明确指出，当前多菌种模型仍属简化体系，尚不能完全代表真实感染中含EPS屏障和复杂微环境的混合群落，因此相关结论仍主要限于体外模型层面。
研究结论可译为：总之，本研究确立了一种具有面性两亲性（facially amphiphilic）的多肽D-PP与不同类别抗生素联用后对复杂成熟生物被膜及休眠细菌群体的干预潜力，而这些靶标与复发性和慢性感染直接相关。除对浮游态革兰阴性菌表现出杀菌作用外，优势联合方案还能够在复杂多菌种聚集体中清除双重异质菌种，而常规抗生素治疗疗效有限。转录组学分析显示，多肽暴露可诱导与细菌转运系统、应激反应及膜完整性相关的差异表达基因，进一步支持D-PP引起的轻度膜去稳定化是其显著增强老旧抗生素对“超级细菌”活性的关键基础。此外，与最后线抗生素多黏菌素B不同，优势联合方案对细菌耐药发展的易感性更低。总体而言，该研究突出显示了AMP模拟多肽作为一种有前景策略，可提升现有抗生素的有效性和持久性，并在治疗持续性、多菌种及生物被膜相关感染方面具有转化潜力。
