《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Investigation of the healing effects of phenylboronic acid and exosome on the TGF-β-Smad/REDD1 pathway in aspartame-induced liver damage in BALB/c type mice
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阿斯巴甜（aspartame, Asp）是一种广泛使用的人工甜味剂，其长期暴露下的潜在肝毒性已引起关注。本研究旨在探讨苯硼酸（phenylboronic acid, PBA）和外泌体（exosomes, Exo）通过调节TGF-β-Smad/REDD1信号通路
阿斯巴甜（aspartame, Asp）是一种广泛使用的人工甜味剂，其长期暴露下的潜在肝毒性已引起关注。本研究旨在探讨苯硼酸（phenylboronic acid, PBA）和外泌体（exosomes, Exo）通过调节TGF-β-Smad/REDD1信号通路（TGF-β-Smad/REDD1 signaling pathways）对雄性BALB/c小鼠慢性阿斯巴甜诱导肝损伤的保护作用。研究人员将小鼠分为七组：对照组（Control）、Exo组、PBA组、阿斯巴甜组（Asp）以及在阿斯巴甜暴露后接受PBA、Exo或其联合治疗的治疗组。收集肝组织进行组织病理学、免疫组织化学和蛋白质印迹分析。慢性阿斯巴甜给药导致明显的肝细胞变性、炎症浸润和结构紊乱。此外，阿斯巴甜暴露显著增加了Smad2/3蛋白表达水平并降低了REDD1蛋白表达水平，表明促纤维化和应激相关信号通路被激活。Asp组中TGF-β、TNF-α、MMP-9和caspase-3阳性细胞数量升高。与这些发现一致，免疫组织化学结果显示治疗组肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）活化减少、凋亡减少以及组织形态改善。此外，PBA和Exo治疗减弱了TGF-β活化，同时上调了REDD1表达。这些发现强调，PBA、Exo及其联合通过调节TGF-β-Smad和REDD1通路发挥显著的肝脏保护作用，为对抗慢性阿斯巴甜诱导的肝损伤提供了一种有前景的治疗策略。
阿斯巴甜（aspartame，Asp）是一种广泛使用的人工甜味剂，其慢性暴露的潜在肝毒性（hepatotoxicity）已引起关注。已有研究将阿斯巴甜与肝炎症、氧化应激和慢性损伤联系起来，但具体机制尚不完全清楚。转化生长因子-β（TGF-β，一种调节细胞生长和分化的细胞因子）在肝纤维化发展中起关键作用，可激活肝星状细胞（HSC，肝脏中的纤维化效应细胞）并促进细胞外基质（ECM）沉积。DNA损伤诱导转录本1（REDD1，也称RTP801或Dig2，一种应激反应蛋白）在肝实质中可拮抗活性氧（ROS）形成。然而，REDD1在非实质肝细胞如HSC中的作用尚未被研究。苯硼酸（PBA，一种硼酸类似物，具有抗氧化和抗炎特性）和外泌体（Exo，细胞外囊泡，介导细胞间通讯）在肝损伤中的治疗潜力尚不明确。因此，本研究旨在评估和比较PBA、Exo及其结合物在慢性阿斯巴甜诱导的BALB/c小鼠肝损伤模型中的保护作用。
研究人员将42只8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为7组：对照组（生理盐水灌胃）、Exo组（尾静脉注射100 μg/小鼠外泌体，第1、7、14天）、PBA组（尾静脉注射33 mg/kg PBA，第1、7、14天）、Asp组（75 mg/kg阿斯巴甜灌胃，连续30天）、Asp+Exo组、Asp+PBA组、Asp+Exo+PBA组（PBA结合外泌体，剂量同前）。实验持续6周，结束时收集肝组织用于组织病理学（H&E、Masson三色、天狼猩红染色）、免疫组化（TGF-β、TNF-α、MMP-9、Caspase-3）和蛋白质印迹（Smad2/3、REDD1）分析。研究获得伊斯坦布尔梅迪波尔大学实验动物伦理委员会批准。主要结论：PBA和Exo通过调节TGF-β-Smad和REDD1通路发挥肝保护作用，为慢性阿斯巴甜诱导肝损伤提供有前景的治疗策略。论文发表在《Biomedicine》。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用雄性BALB/c小鼠（n=42，来自伊斯坦布尔梅迪波尔大学实验动物中心）建立慢性阿斯巴甜诱导肝损伤模型。PBA结合外泌体通过EDC/NHS介导的碳二亚胺偶联化学制备。体内生物分布通过PET-CT成像系统（MILabs）评估，使用DiR荧光染料标记外泌体。肝组织切片进行H&E染色（一般形态）、Masson三色染色（胶原分布）和天狼猩红染色（偏振光下区分I型和III型胶原）。免疫组化检测TGF-β、TNF-α、MMP-9和Caspase-3阳性细胞。蛋白质印迹分析Smad2/3和REDD1蛋白表达。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验。
研究结果：
3.1 体重和总肝重：通过每周称重，Asp组体重显著低于Asp+Exo和Asp+Exo+PBA组（*p<0.05），表明治疗组体重恢复。肝重各组无显著差异，但Asp+PBA组相对肝重显著高于Exo组（**p<0.01）。
3.2 体内生物分布分析：通过CT荧光成像，Exo组荧光信号主要集中于肝脏和腹部；Asp+Exo组信号显著降低（***p<0.001），而Asp+Exo+PBA组信号部分恢复且显著高于Asp+Exo组（**p<0.01），表明PBA结合可增强外泌体在肝脏的积累。
3.3 组织病理学结果：H&E染色显示Asp组肝细胞显著空泡变性、窦状隙扩张、炎症浸润和结缔组织增生；Asp+Exo、Asp+PBA和Asp+Exo+PBA组均显著减少病理改变，其中Asp+Exo+PBA组形态最接近对照组。组织病理学评分在Asp组显著升高，治疗组均显著降低（***p<0.001）。Masson三色染色显示Asp组胶原沉积增加，治疗组减少。天狼猩红染色偏振光下显示Asp组I型胶原百分比显著升高（****p<0.0001），Asp+Exo组显著降低（**p<0.01）；III型胶原在Asp组降低，Asp+PBA组升高，而Asp+Exo+PBA组较Asp+PBA组显著降低（*p<0.05）。
3.4 肝损伤标志物的免疫组化评估：Asp组TGF-β阳性细胞数显著增加（***p<0.001），治疗组均显著减少（Asp+Exo+PBA组*p<0.05）。TNF-α阳性细胞在Asp组显著增加（***p<0.001），Asp+Exo（*p<0.05）和Asp+Exo+PBA（**p<0.01）组显著减少。MMP-9阳性细胞在Asp组显著增加（**p<0.01），Asp+Exo组显著减少（***p<0.001）。Caspase-3阳性细胞在Asp组显著增加（***p<0.001），所有治疗组均显著减少（Asp+Exo**p<0.01，Asp+PBA*p<0.05，Asp+Exo+PBA**p<0.01）。
3.5 蛋白质印迹分析：REDD1蛋白表达在Asp+Exo+PBA组显著高于对照组（**p<0.01），PBA组显著高于Asp组（*p<0.05），且Asp+Exo+PBA组显著高于Exo、Asp、Asp+Exo和Asp+PBA组（*p<0.05至**p<0.01）。Smad2/3蛋白表达在PBA组显著高于对照组和Asp组（*p<0.05），且显著高于Asp+PBA组（****p<0.0001）；Asp+Exo+PBA组显著高于Exo（**p<0.01）和Asp+Exo组（***p<0.001）。
讨论部分总结：研究人员讨论了以下发现：Asp组体重下降可能与能量代谢和食欲调节机制有关，而PBA和Exo治疗可改善代谢紊乱。体内生物分布显示，Asp组肝微环境破坏导致外泌体摄取减少，而PBA结合可部分恢复肝脏积累。组织病理学结果支持PBA和Exo的肝保护作用，与文献报道一致。胶原分析表明，治疗组通过抑制纤维化过程发挥保护作用。免疫组化结果显示，TGF-β、TNF-α、MMP-9和Caspase-3阳性细胞在Asp组增加，治疗组减少，提示PBA和Exo具有抗炎、抗纤维化和抗凋亡作用。REDD1水平在Asp组降低，在外泌体和PBA治疗后升高，可能反映抗氧化和适应性修复反应。Smad2/3表达变化复杂，但需注意仅评估了总蛋白水平，未直接证明通路因果关系。研究局限性包括未进行药理学抑制或基因敲除验证，未来需进一步研究。
研究结论（翻译）：总之，本研究证明慢性阿斯巴甜暴露通过涉及炎症、凋亡和ECM重塑的机制诱导肝损伤，可能由TGF-β/Smad/REDD1信号通路失调介导。PBA和外泌体治疗有效减轻了这些病理改变，突出了其肝保护潜力。这些发现为硼基化合物和外泌体疗法如何通过调节TGF-β相关纤维化和应激反应通路恢复肝脏稳态提供了新见解，有助于支持其抗炎和抗凋亡效力的证据积累。
