含氟异吲哚啉酮-氨基酸杂合物具有体外和体内抗增殖和抗肿瘤活性

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Fluorinated isoindolinone–amino acid hybrids possessing antiproliferative and antitumor activity in vitro and in vivo

　　

当前抗癌疗法的有限疗效和耐药性促使研究人员开发新型药物，特别是针对侵袭性恶性肿瘤。在本研究中，研究人员设计了一系列含氟取代的异吲哚啉酮-氨基酸结合物，并通过表型筛选方法评估其抗增殖活性。研究人员针对肺癌、乳腺癌和皮肤癌细胞系筛选了24个化合物库，其中11个衍生物表现出有前景的抗增殖活性，IC₅₀值范围为7.36至41.99 μM。结构-活性关系（SAR）分析揭示，将三氟甲氧基（-OCF₃）取代与色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）结合能够显著增强活性，相对于三氟甲基（-CF₃）和单氟类似物。先导化合物9c、9d、9e和10c显著抑制癌细胞增殖、克隆形成存活和迁移，同时诱导细胞凋亡和明显的S期细胞周期阻滞。网络药理学鉴定出CDK2和GSK3B为与细胞周期调控相关的关键枢纽基因。机制研究表明，CDK2和PCNA下调、p53-p21信号通路激活以及γ-H2AX表达增加，表明复制相关损伤。分子对接预测了与CDK2催化口袋的有利相互作用，并通过体外CDK2/细胞周期蛋白A2（CyclinA2）激酶抑制和Western blot分析确定的CDK2蛋白表达降低进一步验证，共同表明CDK2是一个关键分子靶点。此外，在4T1小鼠乳腺癌模型中，化合物9c、9d、9e和10c分别表现出显著的肿瘤生长抑制（TGI）值53.50%、79.47%、64.50%和69.14%，且无明显全身毒性。总之，这些发现表明含氟异吲哚啉酮-氨基酸结合物是靶向CDK2相关细胞周期信号通路治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的有前景的抗癌先导化合物。

**论文解读：含氟异吲哚啉酮-氨基酸杂合物的抗肿瘤机制与体内外活性研究**

**研究背景与问题**
癌症仍是全球主要死亡原因，2022年GLOBOCAN数据显示约2000万新发病例和970万死亡病例，其中乳腺癌是女性最常见癌症，三阴性乳腺癌（TNBC）因缺乏激素受体和HER2表达，主要依赖毒性化疗，临床预后较差。现有细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂（CDK4/6i）如Palbociclib等虽改善HR⁺乳腺癌无进展生存期，但耐药性（30%遗传性、70%非遗传性）和血液学毒性（尤其中性粒细胞减少）限制了其疗效。CDK2作为G1/S期转换和S期进程的关键调控因子，在细胞周期蛋白E扩增和RB缺陷型癌症中成为耐药的重要介质，因而靶向CDK2相关通路是克服当前治疗局限的合理策略。异吲哚啉酮骨架在抗癌药物发现中具有重要结构基序，已有多款临床药物（如沙利度胺、来那度胺、泊马度胺等）以此为基础，但该骨架对S期细胞周期调控通路的调节潜力尚待深入探索。研究人员通过引入氟化取代基（如-CF₃和-OCF₃）增强亲脂性和膜通透性，并结合氨基酸结合以改善分子识别和药代动力学特性，设计了一系列含氟异吲哚啉酮-氨基酸结合物，旨在开发新型CDK2靶向抗癌先导化合物。

**研究内容与结论**
研究人员通过表型筛选策略，对24个化合物进行肺癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞系抗增殖活性评估，筛选出11个活性衍生物，其中先导化合物9c、9d、9e和10c表现最优。进一步功能验证显示，这些化合物显著抑制癌细胞克隆形成、迁移，诱导凋亡和S期阻滞。网络药理学结合分子对接、体外CDK2/细胞周期蛋白A2（CyclinA2）激酶抑制实验和Western blot分析，证实CDK2是关键分子靶点，伴随p53-p21通路激活、增殖细胞核抗原（PCNA）下调及γ-H2AX表达升高（DNA损伤标志）。在4T1小鼠乳腺癌模型中，先导化合物（9d最佳）实现79.47%肿瘤生长抑制，且无显著全身毒性（肝肾功能和主要脏器组织学正常）。该研究为开发靶向CDK2相关信号通路的抗TNBC药物提供了新骨架，论文发表在《Biomedicine》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用表型筛选方法，对24个化合物进行肺癌（A549、H1666）、乳腺癌（MCF7、MDA-MB-231、4T1）和黑色素瘤（SK-MEL-2、B16F10）细胞系（来源：NCCS, Pune, India）的MTT细胞毒性测定。网络药理学利用SwissTargetPrediction、SuperPred等数据库预测靶点，结合GeneCards和OMIM数据库的细胞周期相关基因集，通过STRING构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，Cytoscape识别枢纽基因。分子对接使用AutoDock Vina于CDK2晶体结构（PDB ID: 2A4L）进行。体外激酶抑制采用ADP-Glo?法测定CDK2/CyclinA2活性。体内研究在Balb/c小鼠（4T1模型）中进行急性毒性（OECD 425）和疗效评估（n=7），腹腔注射给药，剂量为LD₅₀的1/10。

**研究结果**

**2.1 化学合成**
通过选择性酸介导还原邻苯二甲酰亚胺获得异吲哚啉酮-3-酮（4），再与乙醛酸和氟化苯酚缩合生成α-芳基乙酸衍生物（5-7），最后与氨基酸甲酯经EDC/HOBt偶联得到24个目标化合物。

**2.2 抗增殖活性筛选**
- **2.2.1 体外细胞毒性初筛**：在5种癌细胞系（H1666、A549、MCF7、MDA-MB-231、SK-MEL-2）中，三氟甲氧基（-OCF₃）取代的色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）结合物活性最强，化合物9d在50 μM下使MCF7、MDA-MB-231和H1666细胞活力降至<5%。
- **2.2.2 IC₅₀测定**：11个化合物在8种细胞系（含正常HEK293A）中测定，9d对MCF7（7.36 μM）和H1666（11.57 μM）最敏感，而泊马度胺（Pom）IC₅₀≥50 μM。
- **2.2.3 结构-活性关系（SAR）分析**：取代基活性顺序为-OCF₃ > -CF₃ > -F，与亲脂性（clogP 3.5-4.3）正相关；氨基酸侧链芳香性（Trp > Phe > Tyr）显著增强活性，而脂肪族（Val、Gly）和Pro活性弱。

**2.3 功能验证**
- **2.3.1 克隆形成抑制**：MDA-MB-231细胞中，化合物10d和8c将克隆形成率降至3.18%和4.51%，9d为18.3%，而Pom为64.99%。
- **2.3.2 迁移抑制**：划痕愈合实验中，9c、9d、9e和10c显著抑制伤口闭合（10.42%-15.61%），而8h和9g效果较弱。

**2.4 细胞机制**
- **2.4.1 凋亡诱导**：Annexin V/PI染色显示，9c和9h在12 h诱导早期凋亡（14.33%和19.70%），24 h后10d、10c和9d转向晚期凋亡（46.90%、46.30%和42.60%），呈现时间依赖性。
- **2.4.2 细胞周期阻滞**：流式细胞术显示9c、9d、9e和10c诱导S期细胞比例显著增加（34.7%-52.60%），伴随G1期减少；而8d、9g和9h主要引起G1期阻滞。

**2.5 网络药理学**
通过预测靶点与细胞周期相关基因交集，鉴定出13个枢纽基因（包括CDK2、GSK3B、BCL2、AKT1等），KEGG富集于PI3K-Akt、FoxO、MAPK等通路，CDK2因调控G1/S转换和S期进程被选为后续验证靶点。

**2.6 复制相关通路调控**
qRT-PCR显示9c、9d、9e和10c使CCNA2（cyclin A）上调2-3倍，CCNB1（cyclin B）下调（9d下调20倍），CDK2 mRNA降低4-5倍，P53和P21 mRNA显著升高。Western blot证实PCNA蛋白降低4-6倍，γ-H2AX蛋白升高，表明DNA损伤和p53-p21检查点激活。

**2.7 分子对接与CDK2靶点验证**
分子对接显示9d与CDK2 ATP结合口袋结合最紧密（-10.06 kcal/mol），与Thr14、Asp145等形成氢键。Western blot证实9c、9d、9e和10c使CDK2蛋白表达降低4-5倍，Roscovitine作为阳性对照也显著抑制。

**2.8 体外CDK2激酶抑制**
CDK2/CyclinA2激酶抑制实验表明，9d在30 μM时抑制54.13%，9c为42.59%，9e为36.52%，10c为34.89%，呈浓度依赖性，与活性一致。

**2.9 体内活性与安全性**
- **2.9.1 急性毒性**：LD₅₀值分别为9d（29.50 mg/kg）、9c（34.23 mg/kg）、9e（55.40 mg/kg）等，所有化合物在亚致死剂量下耐受良好。
- **2.9.2 初步疗效**：在4T1模型（n=3）中，9c、9d、9e和10c使肿瘤体积显著减小，从第12天起效果明显。
- **2.9.3 确认疗效**：扩增队列（n=7）中，9d的肿瘤生长抑制率（TGI）为79.47%，9c为53.50%，9e为64.50%，10c为69.14%，而Pom为11.83%。
- **2.9.4 安全性**：血清生化指标（SGPT、SGOT、BUN、肌酐）和主要脏器（肝、肾、脾、心）组织学检查未见明显毒性。

**讨论与结论**
研究人员总结指出，该系列含氟异吲哚啉酮-氨基酸结合物通过抑制CDK2活性，导致复制相关DNA损伤，激活p53-p21通路，诱导S期细胞周期阻滞和凋亡，从而发挥抗肿瘤效应。先导化合物9c、9d、9e和10c在4T1乳腺癌模型中表现出显著肿瘤生长抑制且无系统毒性，为靶向CDK2的TNBC治疗提供了新的骨架先导物，支持进一步优化和临床前开发。