将脂质结合的肿瘤抗原与TLR/STING激动剂结合的多功能纳米疫苗可增强癌症免疫疗法效果

《Cancer Letters》：Multifunctional Nano-vaccines Integrating Lipid-conjugated Tumor Antigens with TLR/STING Agonists Enhance Cancer Immunotherapy

　　

摘要：

尽管目前已有多项基于新抗原肽的癌症疫苗临床试验正在进行，但在实现临床应用方面仍存在诸多挑战，如抗原稳定性差、递送效率低以及免疫激活不足等问题。为解决这些难题，我们开发了一种基于聚合物的多价肽及佐剂（SPPA），它能将脂质结合的肿瘤特异性肽与Toll样受体7/8（3M-052）以及STING（2′3′-cGAMP）激动剂共同递送。这一纳米平台可实现肽的高效包封、持续释放，并精准递送至抗原呈递细胞，从而增强先天性和适应性免疫反应。我们合成并分析了多种脂质结合的肿瘤相关肽及新抗原肽。在体外实验中，SPPA显著提升了促炎基因的表达及细胞因子的分泌，证明了其强大的先天免疫激活作用，同时还能有效促进细胞对靶标的摄取及淋巴系统运输。在体内实验中，单独使用SPPA或与抗PD-1抗体（αPD-1）联合使用，均在四种恶性同源小鼠模型——三阴性乳腺癌（4T1）、HER2⁺乳腺癌（TUBO）、肺癌（LLC1）和肾细胞癌（RENCA）中引发了强烈的细胞毒性T淋巴细胞反应，并抑制了肿瘤生长。这种联合疗法不仅显著降低了肿瘤生长速度，还提升了动物存活率，促进了免疫细胞的浸润，包括CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞和M1型巨噬细胞的增加，同时减少了调节性T细胞和MDSCs的数量。空间转录组学分析显示，肿瘤微环境中存在局部转录重编程现象，即细胞外基质基因表达下降，而炎症通路则被激活。总体而言，这些研究结果表明SPPA是一种高效且多功能的纳米疫苗平台，尤其在与免疫检查点抑制剂联用时，能够诱导持久的抗肿瘤免疫反应。该方法在针对多种实体瘤的个性化免疫治疗领域具有广阔的应用前景。

引言

癌症免疫疗法通过利用宿主免疫系统来消灭恶性细胞，从而彻底改变了肿瘤学领域的发展格局[1]。在各类免疫疗法中，针对PD-1/PD-L1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂已在多种恶性肿瘤中展现出显著的临床疗效[2]。然而，仍有相当比例的患者因T细胞活化不足、免疫排斥或肿瘤微环境具有免疫抑制作用而无法获得治疗效果，甚至出现耐药现象[3]。治疗性癌症疫苗则提供了一种有效的策略，可通过诱导强大的、能识别并清除肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，来克服上述障碍[4]。尤其是基于肽的疫苗，因其易于合成、成本低廉，且可通过下一代测序技术识别肿瘤特异性新抗原来实现个性化定制，因而备受关注[5]、[6]、[7]。尽管具有这些优势，基于肽的疫苗在临床应用中的效果仍受到诸多限制，比如游离肽在体内的快速降解、短线性表位免疫原性较差、抗原呈递细胞对肽的摄取效率低，以及缺乏足以引发良好适应性免疫反应的先天免疫信号通路激活[8]、[9]。其中，抗原稳定性差是导致临床治疗失败的重要原因，因为游离肽抗原会迅速降解并被清除，从而导致抗原持续存在时间短，抗原呈递细胞无法持续接收到足够量的抗原，进而引发弱且短暂的T细胞反应。这在临床上表现为疫苗免疫原性低、不同患者之间的治疗效果差异大，以及多项临床试验中治疗效果有限。试图通过增加给药频率或提高抗原剂量来解决这些问题，往往只会增加治疗负担，却无法真正提升治疗效果[10]。因此，尽管许多基于肽的疫苗在临床前研究中表现优异，但实际临床试验却未能证明其能诱导持久的抗肿瘤免疫反应或带来明显的临床益处。此外，传统的佐剂往往难以激发强烈的细胞免疫反应，也不太适合用于癌症免疫疗法中[11]、[12]。

近年来，纳米技术的进步为解决这些难题提供了创新方案。基于纳米粒子的递送系统不仅能保护肽免受酶解作用，还能实现肽与佐剂的共同递送，同时有助于将药物精准递送至次要淋巴器官[13]、[14]。在各类聚合物纳米载体中，Soluplus作为一种由聚己内酰胺、聚乙酸乙烯酯和聚乙二醇构成的两亲性接枝共聚物，因其具备自组装能力、良好的药代动力学特性，以及能够同时包封亲水性和疏水性物质的特点，而被视为一种极具潜力的递送平台[15]、[16]。与PLGA和PLA等常用聚合物相比，Soluplus在肽疫苗递送方面具有明显优势，它的非晶态两亲性结构使得其在温和条件下即可形成纳米粒子，而且不会产生会破坏肽结构的酸性降解产物[17]、[18]。基于这些文献报道的优势，我们选择Soluplus作为开发SPPA疫苗的聚合物骨架。此外，研究表明，将肽与脂质结合后，可增强其与细胞膜的相互作用，提高抗原呈递细胞的摄取效率，还能促进通过MHC I类途径进行抗原呈递，进而增强细胞毒性T淋巴细胞反应[19]、[20]、[21]。与递送系统的进步相呼应，针对模式识别受体的免疫佐剂也显著提升了疫苗的效能[22]。Toll样受体7/8（TLR7/8）激动剂3M-052以及干扰素基因刺激因子（STING）激动剂环状GMP-AMP（2′3′-cGAMP），这两种免疫刺激剂能够模拟病原体相关的分子模式，从而促进树突状细胞成熟、I型干扰素的生成，进而提升抗原呈递能力[23]、[24]、[25]。不过，传统佐剂往往存在生物分布不佳和产生非靶向毒性的问题，这就凸显出需要借助纳米粒子将佐剂与抗原肽共同递送至目标部位的重要性[26]。

为应对这些多重挑战，我们设计了一种SPPA纳米疫苗，它将脂质结合的肿瘤相关抗原肽与两种免疫刺激佐剂3M-052和2′3′-cGAMP整合到同一个纳米系统中。这种设计不仅实现了高效包封、持续释放以及淋巴系统运输功能，还能提升抗原呈递细胞的摄取效率并帮助其逃避免疫吞噬体，进而实现先天免疫与适应性免疫的协同激活。在本研究中，我们首先合成并分析了多种脂质结合的肿瘤抗原，然后采用纳米沉淀法将它们与Soluplus及相应佐剂结合在一起。我们系统地评估了SPPA的物理化学性质、先天免疫激活效应、向淋巴结的定向输送能力以及抗肿瘤效果，相关实验均在体外和体内条件下开展。通过4T1、TUBO、LLC1和RENCA等多种恶性同源小鼠模型，我们证明了SPPA能够引发强烈的细胞毒性T淋巴细胞反应，重塑肿瘤的免疫微环境，且与αPD-1疗法联用时，可进一步实现持久的肿瘤消退效果。空间转录组学分析则揭示了肿瘤微环境中免疫相关基因和间质相关基因的局部表达变化，为SPPA的疗效提供了更深入的机制解释。总体而言，我们的研究结果表明，SPPA是一种经过精心设计的模块化纳米疫苗平台，在针对多种实体瘤的个性化癌症免疫治疗领域具有巨大的应用潜力。

章节节选

脂质结合脂肽的合成与表征

首先，我们合成了脂质结合脂肽，随后通过高效液相色谱法对其进行了纯化。其结构则通过液相色谱-质谱联用技术进行了鉴定。完整的结构信息、液相色谱分析数据以及质谱分析数据均保存在光谱文件中。本研究中使用的部分肿瘤相关肽，是我们团队之前经过严格验证后筛选出来的，那些抗原已被证实具有免疫原性，

讨论

基于肽的癌症疫苗是一种靶向免疫疗法，通过特定的肽表位来激活肿瘤特异性的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞和CD4⁺辅助T淋巴细胞[29]。虽然这类疫苗在体外实验中可通过诱导免疫记忆和清除肿瘤来展现出色的疗效，但由于免疫原性有限、HLA限制性以及肿瘤的免疫逃逸机制，其临床应用一直面临诸多阻碍[30]、[31]。尽管临床前研究结果十分乐观，但仍有不少基于肽的癌症疫苗

实验动物

本研究所使用的动物为6至8周龄的BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠，这些小鼠均来自我们机构的动物饲养场，且饲养条件符合相关标准。所有动物实验均在严格遵守美国实验室动物护理评估与认可协会制定的准则的前提下进行，相关实验方案也已获得梅奥诊所动物护理委员会的批准（批准编号为IACUC Protocol A00006840-22）

CRediT作者贡献说明

Shamit Kumar Dutta： 方法学研究。 Edward S Famularo： 方法学研究。 Zain Toiemie： 方法学研究。 Keith L. Knutson： 文章撰写与编辑、方法学研究、实验设计、资金获取。 Hari Krishnareddy Rachamala： 文章撰写与编辑、初稿撰写、实验验证、研究监督、方法学研究、实验设计、概念构思。 Krishnendu Pal： 文章撰写与编辑、研究监督、方法学研究。 Debabrata Mukhopadhyay： 文章撰写与编辑、初稿撰写，

数据与材料获取情况

本文及其补充材料中包含了所有用于评估本文研究结论所需的数据。

利益冲突声明

所有作者声明不存在任何利益冲突。

致谢：

本项研究得到了以下机构的资助：美国国立卫生研究院（NIH）提供的R01CA150190项目资助（资助对象为DM），R01NS129671项目资助（资助对象也为DM），以及P30CA015083项目资助；佛罗里达州政府的Casey DeSantis癌症研究计划，其中MOG22-82项目资助对象为DM，而MOG22-57项目则分别资助KK和DM；此外，美国国防部还提供了W81XWH-21-1-0678项目资助，资助对象为KP。我们还要感谢Bio Render公司在图像制作方面给予的帮助。

Hari Krishnareddy Rachamala|Naga Malleswara Rao Nakka|Ramcharan Singh Angom|Fang Wei|Raj Nandani|Zain Toiemie|Edward S. Famularo|Shamit Kumar Dutta|Enfeng Wang|Santanu Bhattacharya|Krishnendu Pal|Keith L. Knutson|Debabrata Mukhopadhyay

美国佛罗里达州杰克逊维尔市，梅奥诊所医学与科学学院生物化学与分子生物学系，邮编32224