基于环状RNA的治疗性疫苗可激发强烈的抗原特异性抗肿瘤免疫反应，并重塑肺癌的肿瘤微环境

《Cancer Letters》：Circular RNA-based therapeutic vaccine elicits potent antigen-specific antitumor immunity and remodels tumor microenvironment in lung cancer

　　

摘要

尽管在传染病防治方面取得了成功，mRNA疫苗在稳定性和免疫原性方面仍存在固有局限。非小细胞肺癌依然是全球癌症相关死亡的主要原因，且晚期患者预后极差，这凸显出亟需新的治疗策略。此前，我们开发了一种无瘢痕的环状RNA合成平台NeoAna，与mRNA相比，它具有更强的稳定性、更持久的抗原表达能力，同时细胞毒性更低。在本研究中，我们以NY-ESO-1作为抗原构建了环状RNA疫苗，并通过脂质纳米颗粒将其递送。该环状RNA疫苗在体外和体内都能引发强烈的先天性和适应性免疫反应。与mRNA疫苗相比，它展现出更出色的抗肿瘤效果，与免疫检查点抑制剂联合使用时，肿瘤抑制率可达93.1%。预防性接种可阻止肿瘤形成，而辅助疗法则能防止肿瘤复发，这说明该疫苗能形成持久的免疫记忆。从机制上看，环状RNA疫苗促进了树突状细胞的成熟，增强了T细胞对肿瘤的浸润，并以CD8⁺ T细胞依赖的方式发挥抗肿瘤免疫作用。此外，单核RNA测序显示，该疫苗能将肿瘤微环境重塑为促炎且抗肿瘤的表型。接种环状RNA疫苗后，肿瘤微环境中的细胞毒性T细胞、促炎巨噬细胞以及抗原呈递的癌相关成纤维细胞的比例均有所上升，同时与免疫相关的信号通路也被激活。总之，我们的研究结果表明NeoAna环状RNA基治疗疫苗具有良好的免疫原性和治疗潜力，为其在临床试验中的进一步应用提供了依据。

引言

与传统疫苗相比，基于RNA的疫苗具有诸多优势，包括高效的递送方式、简单的制备流程、强大的免疫原性，以及无需担心基因组整合的风险。近年来，基于脂质纳米颗粒的mRNA疫苗取得了重要进展，被广泛用于预防传染病和治疗恶性肿瘤，其中代表性的疫苗包括BioNTech的BNT116[1]和Moderna的mRNA-4157[2]。尽管如此，mRNA疫苗仍存在一些固有缺陷，即便经过结构和化学修饰，仍需进一步优化。首先，其生物稳定性较差，易被内源性的核糖核酸酶降解，从而缩短抗原表达的时间。其次，其热稳定性有限，即使在超低温储存条件下，保质期也较短。第三，未经修饰的mRNA分子会被Toll样受体、视黄酸诱导基因I样受体等模式识别受体识别，从而触发先天性免疫反应，加速mRNA的降解[3]、[4]、[5]。虽然N1-甲基假尿苷等化学修饰可显著降低先天性免疫介导的降解，但也会降低免疫原性，进而影响mRNA癌症疫苗的抗肿瘤效果。此外，N1-甲基假尿苷核苷酸会在mRNA翻译过程中导致核糖体移码，从而在小鼠和人类体内引发针对+1移码突变抗原的异常T细胞免疫反应[6]。

环状RNA是一种通过反向剪接自然生成的闭合单链RNA。与线性RNA不同，环状RNA没有5’-3’极性和多聚(A)尾，因此不易被核糖核酸酶降解[7]、[8]、[9]。缺氧且酸性的肿瘤微环境会进一步削弱线性mRNA的稳定性[10]，而环状RNA的闭合结构则使其具备更高的结构稳定性，更能抵御这些恶劣环境。此外，环状RNA的合成相对简单，无需添加5’帽和3’尾。通过引入与帽无关的翻译起始元件和蛋白质编码序列，工程化的环状RNA可实现高效且持久的蛋白质表达[11]、[12]。在结直肠癌和黑色素瘤的小鼠模型中，环状RNA疫苗已展现出抗肿瘤活性[13]、[14]，这表明它有望成为下一代RNA疫苗的开发平台。

肿瘤微环境在免疫逃逸过程中起着关键作用。有效的T细胞免疫依赖于抗原呈递细胞与T细胞之间共刺激信号和共抑制信号的精细平衡[15]。当共抑制信号占主导时，仅靠免疫检查点抑制剂往往不足以完全恢复T细胞的功能[16]、[17]。治疗性癌症疫苗可通过MHC-TCR相互作用提供额外的共刺激信号，从而与免疫检查点抑制剂协同作用，增强T细胞的活化作用。事实上，无论是临床前研究还是临床研究都表明，将mRNA疫苗与免疫检查点抑制剂联合使用是安全的，且能进一步提升抗肿瘤效果[1]、[2]、[18]、[19]。除了增强T细胞反应外，癌症疫苗还有可能重新塑造肿瘤免疫微环境[20]、[21]。例如，Fu等人通过单细胞转录组分析发现，卵清蛋白编码的mRNA疫苗能使黑色素瘤微环境转变为促炎状态[22]。然而，目前尚未探讨环状RNA疫苗调节肿瘤微环境的能力，而这正是本研究要解决的问题。

在本研究中，我们利用NeoAna环状RNA合成平台，开发了一种编码纽约食管鳞状细胞癌1抗原的环状RNA疫苗，这种抗原在多种实体瘤中都会过度表达[23]。我们的研究结果表明，该环状RNA疫苗在体外和体内都具有很强的免疫原性，能够有效激活T细胞免疫。其通过CD8⁺ T细胞发挥的抗肿瘤作用优于mRNA疫苗，与免疫检查点抑制剂联合使用时效果更为显著。疫苗诱导的持久免疫记忆还能保护小鼠免受肿瘤形成和复发的侵害。单核RNA测序进一步表明，这种联合使用方式能改变肿瘤微环境中的免疫格局。总体而言，这些研究结果证明了NeoAna环状RNA系统作为癌症疫苗平台的可行性，同时也凸显了环状RNA疫苗作为一种免疫治疗策略在非小细胞肺癌治疗中的巨大潜力，尤其是与PD-1抑制剂联合使用时。

章节节选

细胞系与培养

人正常肺支气管上皮BEAS-2B细胞、胚胎肾293T细胞以及人肺癌细胞系A549和H1299均购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。过表达NY-ESO-1抗原的小鼠肺癌细胞系LLC^NY-ESO-1是通过用携带CTAG1B基因的慢病毒转导LLC细胞获得的。所有细胞系均在添加了10%胎牛血清的Dulbecco改良 eagle培养基中培养

环状RNA疫苗的合成与表征

这种合成的环状RNA仅包含一个用于启动翻译的内源核糖体进入位点以及抗原编码序列，没有其他外源成分，因此具有更高的生物安全性（图1A）。我们分别合成了编码肿瘤抗原NY-ESO-1的环状RNA（circRNA^NY-ESO-1）和模型蛋白EGFP的环状RNA（circRNA^EGFP），具体方法详见实验部分。核酸电泳结果显示，经过RNase R处理后，circRNA^EGFP和circRNA^NY-ESO-1的丰度有所增加，而mRNA则没有这样的变化

讨论

肺癌仍然是全球癌症相关死亡的首要原因[41]，其中非小细胞肺癌约占所有病例的85%，而且大多数患者在疾病晚期才被诊断出来，因此生存率很低[42]。尽管免疫检查点抑制剂已经取得了一定进展，但只有少数患者能获得持久的治疗效果[43]、[44]，这进一步凸显出需要新的治疗策略。虽然mRNA疫苗在临床应用中展现出良好前景，但其局限性也越来越明显。而环状RNA

结论

总结来说（见图9），本研究表明，基于NeoAna平台的环状RNA疫苗相比mRNA疫苗具有更强的稳定性和更持久的蛋白质表达能力。我们的环状RNA疫苗能够引发强烈的免疫反应，包括细胞毒性CD8⁺ T细胞反应、Th1反应以及体液免疫反应，其抗肿瘤作用主要由CD8⁺ T细胞介导，且效果优于mRNA疫苗。该疫苗还能形成持久的免疫记忆，既能防止原发肿瘤的形成，也能避免术后肿瘤复发

CRediT作者贡献说明

陈少毅：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，软件使用，方法学，研究实施，资金获取，正式分析，数据整理，概念设计。孙泽文：资源提供，资金获取。翁琳：方法学。刘旭：方法学。陈克忠：监督，资源提供，资金获取。邱曼堂：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，监督，项目管理，方法学，资金获取，正式分析

伦理审批

所有动物实验均获得了北京大学健康科学中心动物伦理委员会的批准，并严格遵循相关伦理规范进行。

数据可用性

本研究的所有支持性数据均可在文章正文及其补充信息中找到。研究过程中生成的所有原始数据，也可应合理请求从相应作者处获取。

利益冲突

我们声明不存在任何利益冲突。

资助情况

本研究得到了北京 Nova计划（编号：20240484580）、中华医学科技基金会医疗与健康科技创新项目（编号：2021-I2M-5-002）、北京大学健康科学中心的优秀博士候选人创新基金（编号：BMU2025BSS001）、中国国家自然科学基金（编号：82525052、82373416、82388102、82450111）、北京大学人民医院研发基金（编号：RDL2023-10）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢中国首都医科大学北京中医医院的郑美玲博士、中国空军军医大学唐都医院的刘政博士、中国中山大学肿瘤中心的蔡景生博士以及中国四川癌症医院的李浩然博士，感谢他们在本研究中所给予的帮助。

陈少毅|翁琳|刘旭|孙泽文|白静|王军|陈克忠|邱曼堂

中国北京市100044，北京大学人民医院胸外科