《Current Developments in Nutrition》：Associations Between Red Blood Cell Folate Forms and Demographic, Physiologic, and Lifestyle Factors in the US Population: Cross-Sectional Data from the National Health and Nutrition Examination Survey August 2021–August 2023
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背景 红细胞（RBC）总叶酸（TFOL）是长期叶酸状态的指标。关于RBC叶酸各形式的数据仍然缺乏，而此类数据可能有助于阐明其与健康相关指标之间的关联。
目的 研究人员旨在描述美国人群中RBC叶酸各形式与不同因素之间的关联。
方法 研究人员使用了参加2021
背景 红细胞（RBC）总叶酸（TFOL）是长期叶酸状态的指标。关于RBC叶酸各形式的数据仍然缺乏，而此类数据可能有助于阐明其与健康相关指标之间的关联。
目的 研究人员旨在描述美国人群中RBC叶酸各形式与不同因素之间的关联。
方法 研究人员使用了参加2021–2023周期国家健康与营养调查（NHANES）、年龄≥6岁的个体中5种具有生物活性的RBC叶酸形式数据，即5-甲基四氢叶酸（5-methylTHF）、未代谢叶酸（UMFA）、四氢叶酸（THF）、5-甲酰四氢叶酸（5-formylTHF）和5,10-亚甲烯次甲基四氢叶酸（5,10-methenylTHF）；上述各项之和为TFOL；同时还纳入了1种5-methylTHF的氧化产物MeFox。研究排除了妊娠期/哺乳期女性。采用SUDAN，研究人员评估了叶酸生物标志物与人口学、生理及生活方式变量之间的双变量关联：对于TFOL、5-methylTHF、THF和MeFox，分析其浓度；对于UMFA、5-formylTHF和5,10-methenylTHF，分析其达到或高于检出限（LOD）的患病率，分析对象为年龄≥20岁的个体。进一步在协变量校正后，估计各协变量对生物标志物浓度或比值比的影响。
结果 在年龄≥6岁人群中（n=7126），几何均数浓度（nmol/L）分别为：913（TFOL）、835（5-methylTHF）、26.3（THF）和161（MeFox）；达到或高于LOD的比例（%）分别为：43.6（UMFA）、40.6（5-formylTHF）和73.0（5,10-methenylTHF）；各形式对RBC TFOL的贡献分别为：92.7%（5-methylTHF）、5.02%（THF）和1.61%（5,10-methenylTHF），且该构成随种族/西班牙裔来源而变化。在年龄≥20岁人群中，空腹状态与生物标志物浓度或达到/高于LOD的比例均无关联。在协变量校正前后，生物标志物与以下因素均存在显著关联：年龄（TFOL、5-methylTHF、THF、5,10-methenylTHF）、性别（MeFox）、种族/西班牙裔来源（TFOL、5-methylTHF、THF、MeFox）、体质指数（BMI）（TFOL、5-methylTHF）、烟草使用（TFOL、THF、MeFox）以及叶酸补充剂使用（TFOL、5-methylTHF、THF、MeFox、5-formylTHF、5,10-methenylTHF）。协变量对5-methylTHF、THF或MeFox浓度变异的解释度均≤21%。
结论 叶酸补充剂使用是RBC叶酸生物标志物浓度及检出的最强预测因素。不同种族/西班牙裔来源人群在RBC TFOL中甲基化与非甲基化组成上的差异，提示可能存在潜在的生物学和/或遗传学影响。
本文发表于《Current Developments in Nutrition》，基于美国国家健康与营养调查（NHANES）2021年8月至2023年8月周期数据，系统分析了美国人群红细胞（RBC）叶酸不同化学形式与人口学、生理及生活方式因素之间的关系。研究背景在于，红细胞总叶酸（TFOL）由于反映骨髓造血阶段叶酸摄取，并受到红细胞约120 d寿命的影响，被视为组织叶酸储备和长期叶酸营养状况的重要指标。尽管美国自20世纪70年代起即在NHANES中持续监测血清和红细胞叶酸状态，但传统红细胞叶酸评估方法主要依赖全血叶酸（WB-FOL）、血清叶酸（S-FOL）与红细胞比容（Hct）间接推算RBC TFOL，难以准确区分红细胞内部各叶酸形式。由于不同叶酸形式在全血与血清中的分布并不一致，传统减法校正可能引入误差，也限制了对叶酸代谢生理转变的理解。因此，直接测定红细胞中各叶酸形式，既是营养流行病学监测的重要技术进步，也有助于更细致地理解叶酸营养与健康风险的关系。
研究人员在NHANES 2021–2023周期中首次采用洗涤红细胞样本，利用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS，高效分离并定量多种代谢物的分析技术）直接测量RBC叶酸形式，包括5-甲基四氢叶酸（5-methylTHF，主要循环与储存形式）、四氢叶酸（THF）、5-甲酰四氢叶酸（5-formylTHF）、5,10-亚甲烯次甲基四氢叶酸（5,10-methenylTHF）、未代谢叶酸（UMFA）以及5-methylTHF氧化产物MeFox，并据此计算RBC TFOL。研究对象为年龄≥6岁美国非机构化平民人群，排除妊娠期和哺乳期女性后，纳入7126人进行描述性分析；因部分生理和生活方式变量仅适用于成人，年龄≥20岁者5640人用于关联分析。研究重点包括：描述RBC叶酸形式的分布及彼此相关性；分析其与年龄、性别、种族/西班牙裔来源、炎症、肾功能、BMI、饮酒、烟草使用、叶酸补充剂使用及空腹状态的关系；并比较HPLC-MS/MS直接测得的RBC TFOL与微生物测定法（MBA）间接估算结果之间的差异。
主要技术方法可概括如下：研究基于具有全国代表性的NHANES横断面样本队列，样本来源为2021年8月至2023年8月美国≥6岁人群；实验室方面采用三重盐水洗涤红细胞后制备裂解液，使用HPLC-MS/MS定量6种RBC叶酸相关指标，并在同一裂解液中检测血红蛋白以校正残余水分，再结合平均红细胞血红蛋白浓度换算RBC叶酸浓度；统计方面采用SAS与SUDAAN处理复杂抽样设计，使用加权Spearman相关、双变量分析、多元线性回归和多元Logistic回归评估协变量关联，并与传统MBA法进行方法学比较。
在总体人群特征方面，样本加权后约80.5%为成人，成人中约半数为女性，约60%为非西班牙裔白人（NHW）；约60%处于空腹状态，约20%存在炎症，约35%肾功能轻度下降或存在慢性肾病，约73%超重或肥胖，约17%有烟草使用，约1/3报告过去30 d使用含叶酸膳食补充剂。这样的样本结构为分析不同生理和行为因素与RBC叶酸谱之间的关系提供了基础。
在“Distributions of folate biomarker concentrations measured by HPLC-MS/MS”部分，研究显示，美国≥6岁人群RBC TFOL和各叶酸形式具有明确的分布范围。RBC TFOL中位数为890 nmol/L，5-methylTHF为834 nmol/L，THF为22.2 nmol/L，MeFox为161 nmol/L；而5-formylTHF、5,10-methenylTHF和UMFA整体浓度较低，部分分位数因低于检出限而未报告。该结果说明，RBC内叶酸储存并非单一指标所能完全反映，不同叶酸形式的丰度差异明显。
在“Relative contributions of RBC folate forms to RBC TFOL by HPLC-MS/MS”部分，研究发现5-methylTHF是RBC TFOL的绝对主要构成，贡献约92.7%；THF与5,10-methenylTHF分别仅占5.02%和1.61%。这一构成在不同年龄和性别间总体较稳定，但在种族/西班牙裔来源之间存在显著差异。非西班牙裔黑人（NHB）人群THF和5,10-methenylTHF占比更低，因此5-methylTHF占比更高；西班牙裔人群THF和5,10-methenylTHF占比最高。按RBC TFOL十分位分层后，5-methylTHF随总叶酸水平近线性升高，而THF和5,10-methenylTHF在高十分位中上升更明显，提示高叶酸状态下非甲基叶酸成分也发生变化。
在“Correlations among folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS”部分，研究表明RBC各叶酸生物标志物之间均存在显著相关。TFOL与5-methylTHF相关性极强（r=0.95），与MeFox也高度相关（r=0.88）；5-methylTHF与MeFox相关性为0.93，提示RBC中MeFox与5-methylTHF关系极为密切。THF与5,10-methenylTHF也呈强相关（r=0.75），提示这两种非甲基叶酸形式可能具有协同变化特征。血清与RBC同类叶酸形式之间相关性仅为弱到中等，说明不同生物基质中的叶酸形式具有不同生物学指示意义。
在“Major folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS – Concentrations by demographic characteristics”部分，研究显示TFOL、5-methylTHF、THF和MeFox在年龄、性别及种族/西班牙裔来源间存在显著差异。老年人浓度较高，青少年最低，整体呈轻度U形趋势；女性高于男性；非西班牙裔白人浓度最高，而NHB较低。按叶酸补充剂使用分层后，年龄和性别差异在补充剂使用者中更明显，提示补充剂使用对这些人口学差异具有强化作用。
在“Major folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS – Concentrations by physiologic and lifestyle characteristics”部分，双变量分析显示空腹状态与主要RBC叶酸生物标志物无关。肾功能下降、未使用烟草以及叶酸补充剂使用与4项主要生物标志物浓度升高一致相关；BMI升高与TFOL、5-methylTHF和MeFox增加相关；炎症仅与TFOL轻度升高相关；饮酒与部分指标有关，但模式较复杂。该结果提示，长期叶酸状态受若干生理和生活方式因素共同影响，但不同叶酸形式的响应并不一致。
在“Minor folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS – Prevalences ≥LOD by demographic characteristics”部分，研究发现总体检出率分别为UMFA 43.6%、5-formylTHF 40.6%、5,10-methenylTHF 73.0%。年龄对3项次要叶酸形式均有显著影响，老年人检出率通常更高；种族/西班牙裔来源仅对5,10-methenylTHF有显著影响，NHW检出率较高。补充剂分层后，部分差异减弱或改变，提示补充剂使用对次要叶酸形式的存在具有重要影响。
在“Minor folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS – Prevalences ≥LOD by physiologic and lifestyle characteristics”部分，研究显示空腹和炎症状态与UMFA、5-formylTHF、5,10-methenylTHF的检出率无关。肾功能下降与5-formylTHF和5,10-methenylTHF检出率升高相关；BMI升高与UMFA和5,10-methenylTHF检出率上升相关；叶酸补充剂使用显著提高5-formylTHF和5,10-methenylTHF检出率；烟草使用仅与5,10-methenylTHF略有关联；饮酒无显著关联。
在“Major folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS – Multiple linear regression modeling to estimate adjusted percent differences in RBC folate biomarkers”部分，多变量校正后，许多双变量关联减弱。保留下来的显著因素包括：年龄与TFOL、5-methylTHF、THF相关；性别仅与MeFox相关；种族/西班牙裔来源与4项主要指标均相关；肾功能仅与TFOL相关；BMI与TFOL、5-methylTHF、MeFox相关；烟草使用与TFOL、THF、MeFox负相关；叶酸补充剂使用与所有4项主要指标均呈最强正相关。补充剂使用使各指标升高约35%–45%，是最强预测因素。然而模型解释度有限，5-methylTHF、THF和MeFox的变异解释度分别仅为21.2%、9.4%和18.2%，表明尚有其他未测因素影响RBC叶酸谱。
在“Minor folate biomarkers measured by HPLC-MS/MS – Multiple logistic regression modeling to estimate ORs for RBC folate biomarker concentrations ≥LOD”部分，多变量分析后显著关联进一步减少。年龄仅与5,10-methenylTHF可检出性相关；BMI仅与5-formylTHF可检出性相关；叶酸补充剂使用显著提高5-formylTHF和5,10-methenylTHF达到检出限以上的几率。UMFA在校正后未与补充剂使用相关，这一结果与其在三重洗涤RBC中仅少量存在、可能更多反映残余血清痕量污染而非成熟红细胞内真实储留相一致。
在“Comparison of RBC TFOL measured by HPLC-MS/MS vs MBA”部分，研究直接比较了新旧两种RBC TFOL评估方式。HPLC-MS/MS直接测得的RBC TFOL与MBA间接计算值高度相关（Lin’s r=0.91），但平均低14%。这种系统性差异在不同人口学亚组中较稳定。尽管两方法估计的叶酸缺乏率均<1%，差异很小，但在育龄女性（WRA）中叶酸不足率差异明显：HPLC-MS/MS为38.4%，MBA为21.7%。这说明即便平均差异仅约15%，也可能显著影响公共卫生解释，尤其是在使用基于MBA建立的阈值判断叶酸不足时，未来可能需要建立检测方法特异性的界值。
讨论部分强调了几项核心认识。首先，这是首次在美国全国代表性样本中系统报告RBC叶酸形式及其与多类因素的关系。其次，叶酸补充剂使用是最强、最稳定的决定因素，提示在美国强制叶酸强化和补充剂广泛使用的背景下，补充暴露深刻影响RBC叶酸谱。再次，不同种族/西班牙裔来源之间RBC叶酸组成差异明显，尤其是NHB人群非甲基叶酸成分较低，而5-methylTHF占比更高。论文讨论指出，这种现象可能与亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）677 C>T多态性有关，但作者使用的是“提示”与“可能”层面的表述，核心结论仍限于观察到表型差异。研究还指出，RBC中的MeFox更像是5-methylTHF状态的替代指标，而不同于既往血清研究中其可能反映不良健康因素的解释，进一步说明同一叶酸形式在不同基质中的生物学意义不同。最后，RBC叶酸因在红细胞形成时固定、生命周期内相对稳定，相较血清叶酸受即时摄入影响更小，因此在校正后与协变量的关联通常少于血清叶酸。
研究结论可译为：据研究人员所知，这是首次在大规模、具有全国代表性的人群中报告红细胞叶酸各形式与人口学、生理及生活方式因素关联的研究。在美国人群中，叶酸补充剂使用是红细胞叶酸生物标志物浓度及检出的最强预测因素。叶酸各形式会因检测基质（RBC与血清）及其生物学定位不同而代表不同指标。鉴于美国已实施近30年的强制性叶酸强化，且人群叶酸补充剂使用率较高，这些发现能否在叶酸暴露和叶酸营养状态较低的其他人群中得到重复，仍有待进一步观察。
