《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：A newly developed rapid K39-based LeishmaCHECK Ab ELISA for high-throughput serological screening of canine leishmaniasis
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犬利什曼病（CanL）是由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的一种人兽共患媒介传播疾病，犬作为主要储存宿主在人群感染维持中具有关键作用。可靠的血清学评估对疾病监测与控制至关重要。研究人员描述并验证了LeishmaCHECK Ab EL
犬利什曼病（CanL）是由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引起的一种人兽共患媒介传播疾病，犬作为主要储存宿主在人群感染维持中具有关键作用。可靠的血清学评估对疾病监测与控制至关重要。研究人员描述并验证了LeishmaCHECK Ab ELISA，一种用于检测犬血清中抗L. infantum抗体的新型快速定性与半定量检测。截断值（cut-off）通过多种统计方法确立，包括Youden指数与受试者工作特征（ROC）曲线分析。该检测在552份犬样本（313阳性、206阴性、33临界）中以IFAT为参考血清学方法进行评估。LeishmaCHECK Ab ELISA与IFAT表现出极高一致性（Cohen’s kappa为0.93），相对敏感性95.2%，相对特异性最高达99.5%。比较分析亦显示其诊断性能优于其他市售ELISA。结果表明，LeishmaCHECK Ab ELISA是犬利什曼病血清学筛查的可靠替代工具。
研究背景方面，犬利什曼病（Canine leishmaniasis, CanL）由Leishmania infantum引起，犬为核心储存宿主，对人兽共患传播具有决定意义。现行诊断依赖寄生虫学、血清学与分子方法；其中间接荧光抗体试验（IFAT）被世界动物卫生组织（WOAH）列为参考血清学方法，但需专业设备与判读经验，且可能与其他锥虫发生交叉反应。酶联免疫吸附试验（ELISA）性能高度依赖包被抗原，重组K39因在利什曼病无鞭毛体中高表达且含串联重复表位，成为人犬内脏利什曼病（VL）血清诊断最广泛使用的抗原之一。然而，现有市售ELISA在敏感性、特异性及对低滴度或临界样本处理上仍存差异。为此，研究人员以意大利与希腊临床送检犬血清/血浆为对象，开发基于重组K39的LeishmaCHECK Ab ELISA，并以IFAT为参照完成验证，论文发表于《Current Research in Parasitology》。
主要关键技术方法方面，研究人员建立来自意大利中北部及希腊阿提卡地区兽医门诊的异质性犬样本队列（共552份，经IFAT以1:80为界预分类为阳/阴/临界），在Nunc MaxiSorp微孔板以0.5 μg/ml重组L. infantum K39包被、BB2封闭，样品1:100稀释后30分钟室温孵育，继以1:80,000 HRP标记抗犬IgG二抗15分钟、TMB显色10分钟、450 nm读数；以抗His标签HRP抗体为正控、样品稀释液为负控。截断值由负样均值+3SD、ROC曲线及Youden指数共同确定；性能评估采用与IFAT比对计算相对敏感性/特异性、Cohen’s kappa、PPV/NPV；精密度按批内批间8复孔×3批次评价；并与市售Leiscan（HIPRA）及INgezim Leishmania（GSD）ELISA头对头比较；交叉反应用46份Ehrlichia canis IFAT/ELISA双阳样检测；稳定性参照ASTM F1980-21加速老化（37℃ 6周推算2–8℃ 18个月）。
研究结果部分，3.1节通过PolySorp与MaxiSorp初筛及K9-K26-K39、K39±LACK组合优化，确定MaxiSorp+0.5 μg/ml K39+BB2+二抗1:80,000+30/15/10 min方案最优，101例子集上相对敏感性/特异性达100%/100%（kappa=1.000）。3.2节以132例（66阳66阴）确立cut-off为OD 0.460，±10%为可疑区，ROC与Youden（J=0.985）交汇验证。3.3节在552例全集（排除临界时）获相对敏感性95.2%、特异性99.5%、kappa 0.936、准确率96.9%；将临界归为阴时特异性98.7%、kappa 0.934，高脂溶血无干扰。3.4节批内CV≤6.81%、批间CV≤5.69%，符合ICH Q2(R1)精密度要求。3.5节与Leiscan比，338例排除临界时LeishmaCHECK敏感性97.4%/特异性99.5%/kappa 0.970，优于Leiscan的94.1%/98.9%/0.934；370例含临界时性能仅微降；LeishmaCHECK OD与Leiscan推估IFAT滴度强线性（R2=0.979）。3.6节与INgezim比，82例排除临界时LeishmaCHECK敏感性76.2%/特异性100%/kappa 0.757，显著优于INgezim的66.7%/92.5%/0.588；两ELISA直比kappa 0.819。3.7节46份E. canis阳性样K39-ELISA全阴，无交叉反应；加速老化6周活性留存>70%，支持2–8℃ 18个月货架期。
讨论部分指出，以IFAT为单一参考可能引入偏倚，故研究人员增设市售ELISA对照；临界滴度（1:80）归属处理对指标有轻微影响但不改优势结论。K39优选因其无鞭毛体高表达与重复表位驱动强体液应答，但对无症状感染、皮肤型利什曼病（CL）及治疗后抗体回落敏感度下降，15例假阴中部分系治疗犬或极早期未转阳，亦不能排除前带（prozone）效应。交叉反应评估限于E. canis，未现干扰。稳定性推估借ASTM F1980-21阿伦尼乌斯模型，非兽医诊断试剂盒专属法规框架。
结论部分翻译：利什曼病在人犬群体控制均具挑战，CanL诊断须结合临床史与体征。在此框架下，LeishmaCHECK Ab ELISA约1小时出定性半定量结果，无需恒温设备，阳性高度提示活动感染，应与临床实验室发现联判；无症状/亚临床、CL或前带效应可致假阴，药物治疗亦可降低抗K39抗体水平从而影响敏感性。该检测在临界血清状态与低滴度样本中表现稳定，凸显诊断稳健性，其治疗后监测潜力待究。综上，LeishmaCHECK Ab ELISA可作为IFAT的实用、稳健、可靠替代用于犬利什曼病常规血清学筛查。
