视网膜神经节细胞轴突选择性交叉中的细胞外基质：β2层粘连蛋白调控同侧投射

《Developmental Biology》：The extracellular matrix in selective decussation of retinal ganglion cell axons: β2 laminins regulate the ipsilateral projection

　　

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  基因缺失β2层粘连蛋白会增加同侧神经束中不交叉的视网膜神经节细胞轴突的比例
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  β2层粘连蛋白对于视交叉软脑膜基底的完整性以及放射状胶质细胞的排列至关重要
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  在轴突交叉的后期阶段，Lamb2^-/-模型中放射状胶质细胞仍持续表达同侧轴突引导信号EphrinB2，而这一表达通常会在正常发育时段结束后停止
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  Lamb2^-/-模型中的视网膜神经节细胞数量有所增加

引言

视网膜神经节细胞通过其轴突将视觉信息从视网膜传递到大脑，这些轴突共同构成视神经和神经束。视网膜神经节细胞会伸出轴突，离开眼睛后延伸至腹侧中脑部，进而形成视交叉。在这个关键节点上，视网膜神经节细胞的轴突会被选择性地引导：要么越过中线进入对侧视神经束，要么不跨越而保持在同侧，这一过程被称为选择性交叉。这种对视网膜神经节细胞轴突的定向引导有助于有序构建实现双眼视觉所需的神经回路。

在视交叉形成过程中，视网膜神经节细胞轴突的选择性交叉是由腹侧中脑部的放射状胶质细胞和中线神经元共同调控的（Marcus等人，1995；Sretavan等人，1994）。这些细胞会表达不同的轴突引导信号，这些信号会根据不同发育阶段来指导轴突的走向——即决定此时哪些视网膜神经节细胞正在向视交叉延伸轴突（Petros等人，2008）。在发育高峰期（小鼠的E14–E17阶段），来自背鼻侧和腹颞侧视网膜的视网膜神经节细胞会到达中脑部。中线神经元表达的PlexinA1，以及放射状胶质细胞表达的Sema6D和NrCAM，共同促使背鼻侧的轴突发生交叉（Kuwajima等人，2012；Williams等人，2006）。与此同时，来自不发生交叉的腹颞侧视网膜神经节细胞的轴突，则会因放射状胶质细胞短暂表达EphrinB2而引导至同侧神经束。在发育后期阶段（小鼠的E17–P0阶段），EphrinB2的表达会下降，此时腹颞侧视网膜最后出生的视网膜神经节细胞的轴突则会被引导至对侧。因此，视交叉的形成是通过一系列动态调节轴突走向的引导信号表达程序来实现的。

视网膜神经节细胞轴突的选择性交叉还受其定位特性的影响。视网膜神经节细胞会根据其神经发生的时机以及出生位置来确定是走向同侧还是对侧。对侧的视网膜神经节细胞在发育早期形成，其生成由转录因子Pou3f1和Isl2调控（Fries等人，2023；Kuwajima等人，2012；Marcucci等人，2019；Pak等人，2004）。如果Pou3f1或Isl2基因被删除，同侧视网膜神经节细胞的数量就会增加，这说明这两种转录因子通过抑制同侧命运来促进对侧命运的形成。SoxC转录因子（Sox 4、11和12）并不直接决定视网膜神经节细胞的命运，但会促进其对侧分化的同时，也促进PlexinA1和NrCam等轴突引导信号的表达（Kuwajima等人，2017）。相比之下，同侧视网膜神经节细胞则在较晚时期形成，其生成由转录因子Zic2调控（Herrera等人，2003）。Zic2还会促进酪氨酸激酶受体EphB1的表达，该受体有助于视网膜神经节细胞避开中线（Lee等人，2008）。

视网膜神经节细胞轴突的选择性交叉还受到细胞外基质所提供的信号调控。诸如透明质酸以及肝素硫酸盐和软骨素硫酸盐蛋白聚糖等丰富的细胞外基质蛋白，都能影响轴突的交叉过程（Brittis等人，1992；Conway等人，2011；Lin等人，2007；Pratt等人，2006）。另一类参与轴突引导的细胞外基质蛋白则是层粘连蛋白。层粘连蛋白是由α、β和γ链组成的异三聚体分子，是基底膜的重要组成部分，而基底膜是一种特殊的细胞外基质结构，可作为信号平台来调节细胞的黏附、增殖和分化（Yurchenco，2011）。在缺乏同侧投射的斑马鱼中，编码层粘连蛋白α1、β2和γ1链的Lama1、Lamb2和Lamc1基因发生突变后，会导致轴突错误地指向大脑的同侧（Barresi等人，2010；Karlstrom等人，1996；Paulus和Halloran，2006）。进一步支持层粘连蛋白在轴突引导中的作用的是，作为典型的层粘连蛋白受体的 dystroglycan也与视网膜神经节细胞轴突的交叉过程有关（Clements和Wright，2018）。

在小鼠体内，含有β2亚基的层粘连蛋白在视网膜的内限膜以及大脑的软脑膜基底膜中含量丰富（Hunter等人，1992；Libby等人，2000；Radner等人，2013）。我们推测，小鼠视交叉软脑膜基底膜中的β2层粘连蛋白在视网膜神经节细胞轴突的选择性交叉过程中起着重要作用。我们的研究发现，基因缺失β2层粘连蛋白后，进入同侧神经束的不交叉轴突比例会增加。β2层粘连蛋白的缺失还会导致软脑膜基底膜出现结构破坏，同时也会改变放射状胶质细胞的基底突起和末端结构。这些关于视交叉特殊微环境的研究结果表明，轴突引导信号的表达也可能随之发生变化。我们发现，同侧轴突引导信号EphrinB2的蛋白质表达会超出其正常的发育时间范围，这很可能使得同侧引导的作用持续时间延长至视网膜神经节细胞轴突选择性交叉的后期阶段。此外，我们还在轴突交叉的后期阶段观察到同侧视网膜神经节细胞的数量有所增加。综合这些结果来看，β2层粘连蛋白有助于维持软脑膜基底膜的完整性以及放射状胶质细胞的正常结构，而这些功能可能对于将EphrinB2蛋白的表达时间限制在视网膜神经节细胞轴突引导的高峰期而言是必要的。在视网膜中，β2层粘连蛋白或许也能通过影响视网膜神经节细胞与内限膜的黏附，进而影响同侧视网膜神经节细胞的神经发生及其命运。

章节摘要

实验动物

本研究使用了C57BL/6J野生型小鼠、Lamb2^-/-（Lamb2^tm1Jrs）小鼠以及Lamc3^-/-（Lamc3^tm1.1Wjbr）小鼠。Lamb2和Lamc3基因的删除以及相应敲除品系的构建方法已在先前文献中有描述（Noakes等人，1995；Li等人，2012）。Lamb2品系以杂合子形式维持，而Lamc3品系则以纯合子形式维持。实验中并未对胚胎的性别进行检测。观察到阴道栓出现的那一天被定义为E0.5阶段。为了收集胚胎，怀孕的母鼠

选择性轴突交叉发生时，β2和γ3层粘连蛋白亚基在视交叉和视网膜中均有表达

位于脑腹侧的视交叉下方存在软脑膜基底膜。该基底膜中富含含有β2和γ3链的层粘连蛋白（Hunter等人，1992；Libby等人，2000；Radner等人，2013）。因此，我们决定研究这些层粘连蛋白在视交叉中的分布情况。我们使用之前已鉴定出的针对层粘连蛋白β2链和γ3链的特异性抗体，对E15.5和E17.5阶段胚胎的切片进行了免疫标记（Li等人，2012；Sasaki等人，2002）。这些抗体能够检测到层粘连蛋白

讨论

我们的研究结果表明，发育中的视交叉和视网膜中的β2层粘连蛋白在调控同侧投射的大小方面起着重要作用。在视交叉中，β2层粘连蛋白有助于维持软脑膜基底膜的完整性，以及放射状胶质细胞基底突起的正常结构，还能保证附着在软脑膜基底膜上的放射状胶质细胞末端结构的正常发育。此外，在轴突交叉的后期阶段，放射状胶质细胞中仍持续存在EphrinB2蛋白。我们的研究结果表明，限制EphrinB2的

CRediT作者贡献说明

Reyna Isabel Martinez-De Luna：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化分析，验证实验，实验监督，资源提供，项目管理，方法设计，研究执行，资金申请，正式数据分析，概念构思。Madeline Turo：研究执行。Adam N. Robinson：研究执行。Danny Yeo：研究执行。Skylyn McNamara：研究执行。Alanis Hernandez-Arce：写作——审阅与编辑，验证实验，方法设计，研究执行，正式数据分析

利益冲突声明

无

致谢

我们要感谢Brunken实验室、Viczian实验室和Zuber实验室的成员们，他们为我们提供了宝贵的讨论意见和深刻见解。同时，我们也要感谢William Brunken博士，他提供了Lamb2^-/-和Lamc3^-/-小鼠、相关试剂，还允许我们使用他的实验室来开展这项研究。此外，我们还要感谢Dale Hunter博士和Michael E. Zuber博士对手稿的仔细审阅，以及Francisco J. Agosto-Perez提供的用于样本盲法分析的Python脚本。本研究得到了NIH为推动RMDL领域多样性而设立的科研补贴项目以及NEI的资助。

Alanis Hernandez-Arce|Madeline Turo|Adam N. Robinson|Danny Yeo|Skylyn McNamara|Reyna I. Martínez-De Luna