神经元源性神经营养因子阳性中间神经元：抗癫痫疗法的细胞靶点

《eBioMedicine》：Neuron-derived neurotrophic factor-positive interneurons: a cellular target for anti-seizure therapies

　　

背景：癫痫药物治疗失败是常见的，这证明有必要为先进疗法确定最佳细胞靶点。抑制性系统的基因操作原则上提供了一种精细调节的干预措施，这是通过广泛降低锥体神经元兴奋性所无法实现的。在此背景下，表达神经元源性神经营养因子的中间神经元（NDNF+）可引发由GABA_A和GABA_B受体介导的持久抑制。然而，它们在癫痫样活动期间抑制过度兴奋方面的贡献仍未得到探索。方法：为解决这一问题，研究人员在NDNF-Cre小鼠品系中采用钙成像、光遗传学和化学遗传学，以研究NDNF+中间神经元如何影响皮质和海马过度兴奋以及自发性癫痫发作。结果：研究人员表明，NDNF+中间神经元在发作间期棘波和局灶性癫痫发作期间被积极募集，尽管比小清蛋白阳性中间神经元更慢（平均差异：2.8秒，p = 0.023）。NDNF+中间神经元的光遗传学超极化加剧了癫痫放电（归一化癫痫发作持续时间平均差异：0.23，p = 0.0474），而它们的去极化抑制了局灶性癫痫发作，即使光遗传学刺激在癫痫发作开始后延迟数秒也是如此（归一化癫痫发作持续时间平均差异：?0.27，p = 0.03）。这种效应主要由GABA_B受体介导。此外，NDNF+中间神经元的化学遗传学去极化在海马中具有显著的抗癫痫效应，无论是在离体（归一化癫痫发作持续时间平均差异：?0.92，p < 0.001）还是在体内。解释：总体而言，这些发现确立了NDNF+神经元即使在癫痫活动期间也是皮质和海马兴奋性的关键调节因子，并将它们确定为开发抗癫痫疗法的有前景的细胞靶点。

**论文解读：NDNF+中间神经元——抗癫痫疗法的潜在细胞靶点**

**研究背景与问题**

癫痫影响约1%的人口，其中约30%的病例对药物治疗耐药。尽管在过去30年间引入了超过15种新型抗癫痫药物，但耐药率并未改变，这凸显了寻找新治疗方法的迫切性。耐药性局灶性癫痫是重大未满足的临床需求，其唯一实现无发作的选择是破坏性且不可逆的手术，可能带来终身后遗症。因此，开发新的基因疗法成为焦点，这些疗法通常涉及降低锥体神经元兴奋性或增强中间神经元介导的抑制。然而，干扰兴奋性神经元可能扰乱正常皮质处理，而操纵抑制性系统则因中间神经元的多样性而复杂，但提供了更精细的干预。在抑制性中间神经元中，表达神经元源性神经营养因子（NDNF+）的神经胶质样（NGF）细胞具有独特的特性：它们通过释放大量GABA进入细胞外空间（体积传递），引发由GABA_A慢速型和GABA_B受体介导的持久抑制，并调节树突兴奋性。然而，NDNF+中间神经元在癫痫样活动期间对抑制过度兴奋的贡献此前尚未被探索。此外，其他主要中间神经元类型（如PV+和SOM+）在癫痫中的抑制效应会迅速减弱，限制了其作为细胞靶点的价值。因此，需要研究NDNF+细胞是否能在癫痫活动中维持持续抑制，并评估其作为抗癫痫疗法的候选靶点。

**研究内容与结论**

研究人员利用NDNF-Cre小鼠品系，结合钙成像、光遗传学和化学遗传学技术，在多种离体和在体皮质及海马癫痫模型中系统研究了NDNF+中间神经元对过度兴奋性和自发性癫痫发作的控制作用。研究发现：NDNF+中间神经元在发作间期棘波和局灶性癫痫发作期间被激活，但募集速度显著慢于PV+中间神经元；光遗传学抑制NDNF+细胞会加剧癫痫放电，而激活它们则能抑制癫痫发作，且这种抑制效应即使在癫痫发作开始后数秒延迟仍能维持，这与PV+和SOM+细胞不同；该抗癫痫作用主要由GABA_B受体介导；化学遗传学激活NDNF+细胞在离体海马切片和慢性颞叶癫痫（TLE）在体模型中均表现出显著的抗癫痫效应。这些发现确立了NDNF+神经元作为皮质和海马兴奋性的关键调节因子，并表明它们是有前景的抗癫痫疗法细胞靶点。该论文发表在《eBioMedicine》。

**关键技术方法概述**

研究人员使用了NDNF-Cre小鼠品系（来源：Jackson实验室），并通过立体定位注射腺相关病毒（AAV）载体实现基因表达。主要技术包括：1）**钙成像**：利用AAV9-hSyn-FLEX-GCaMP6f和AAV9-mDlx-FLEX-mCherry共注射，结合双光子显微镜和皮层电图（ECoG）记录，在毛果芸香碱诱导的局灶性癫痫模型中实时监测NDNF+神经元的钙活动。2）**光遗传学**：分别表达抑制性光敏蛋白ArchT或兴奋性光敏蛋白Chronos（由mDlx启动子驱动），通过光纤在清醒头固定小鼠中实现NDNF+细胞的超极化或去极化，并实时检测癫痫发作触发闭环刺激。3）**化学遗传学**：表达兴奋性DREADD受体hM3Dq（由mDlx启动子驱动），通过腹腔注射其激动剂去氯氯氮平（DCZ）或氯氮平-N-氧化物（CNO）实现NDNF+细胞的长时程激活。实验还涉及离体脑片全细胞记录、免疫组化以及慢性海马内红藻氨酸注射癫痫模型（样本来自NDNF-Cre小鼠，雄性及雌性，2-6月龄）。

**研究结果**

**1. NDNF-Cre可靶向具有NGF中间神经元典型特征的层1细胞**
通过免疫组化和电生理学表征，研究人员确认NDNF-Cre小鼠品系优先靶向NGF细胞，这些细胞表达NGF标志物reelin和神经肽Y（NPY），且不表达VIP。使用中间神经元特异性增强子mDlx后，基因表达几乎仅限于层1，避免了对深层锥体神经元的异位表达。NDNF+神经元表现出早发放或晚发放特性，其光遗传学激活在锥体神经元中诱发了由GABA_B和GABA_{A, slow}受体介导的持久IPSP。

**2. 癫痫样活动期间NDNF+细胞的钙荧光延迟升高**
在毛果芸香碱诱发局灶性癫痫的在体模型中，钙成像显示NDNF+细胞在发作间期棘波和癫痫发作期间均被激活，但激活潜伏期是PV+细胞的两倍以上（平均差异2.84秒，p=0.023），表明其募集较慢。

**3. 光遗传学超极化NDNF+细胞加剧癫痫样活动**
通过表达抑制性光敏蛋白ArchT并给予570 nm激光，超极化NDNF+细胞导致发作间期棘波频率轻度但显著增加（p=0.027），并延长局灶性癫痫发作持续时间约20%（p=0.0474），表明NDNF+神经元在局部抑制病理活动。

**4. 光遗传学去极化NDNF+细胞持续抑制癫痫样活动**
通过表达兴奋性光敏蛋白Chronos并给予470 nm激光，激活NDNF+细胞显著减少发作间期棘波数量（p=0.046），并缩短癫痫发作持续时间约20%（p=0.003），且该效应在50-100 Hz刺激频率下最强。与PV+和SOM+细胞不同，NDNF+细胞激活后无明显的反弹性活动增加。

**5. GABAB受体介导的NDNF+细胞在癫痫中的持续抑制**
当光遗传学激活延迟至癫痫发作开始后>2秒时，NDNF+细胞仍能显著缩短癫痫发作持续时间约30%（p=0.026），而PV+和SOM+细胞的抗癫痫效应在此延迟条件下消失甚至转为促癫痫。局部应用GABA_B受体拮抗剂CGP55845完全消除了NDNF+细胞的抗癫痫效应，并使其转为促癫痫（p=0.009），表明GABA_B受体是关键介质。

**6. 化学遗传学激活NDNF+细胞在皮质和海马复发性癫痫模型中具有抗癫痫作用**
在离体皮质切片模型中，表达hM3Dq的NDNF+细胞在CNO作用下，癫痫样事件的棘波间期显著增加（p=0.01），但发作持续时间无显著变化。在海马-内嗅皮质切片模型中，CNO激活hM3Dq后，癫痫样事件持续时间（p<0.001）和棘波数量（p=0.006）均显著减少。在慢性颞叶癫痫在体模型中，NDNF+细胞在癫痫后未出现数量减少（p=0.072），表明其对损伤相对耐受。腹腔注射DCZ激活hM3Dq后，癫痫负担（发作时间）显著减少（p=0.033），首次发作潜伏期有增加趋势（p=0.062）。

**讨论与结论**

**讨论总结**：NDNF+中间神经元在癫痫活动中提供持续的抑制性约束，这与PV+和SOM+细胞不同，后者的抑制效应随时间减弱甚至反转。这种持续性主要归因于GABA_B受体介导的抑制，独立于GABA_A受体依赖的氯离子负荷。NDNF+细胞的缓慢募集可能源于其位于层1的解剖位置、晚发放特性及NMDA受体依赖的树突整合。化学遗传学激活NDNF+细胞在慢性颞叶癫痫模型中显示出抗癫痫潜力，且NDNF+细胞在病理条件下存活良好，其标志物在人脑中保守，提示转化潜力。此外，NDNF+细胞表达NPY可能额外贡献抗癫痫效应。然而，研究仍为探索性，需在更大样本和更多慢性模型中验证，并评估其认知功能副作用。

**研究结论翻译**：总之，这些发现确立了NDNF+神经元即使在癫痫活动期间也是皮质和海马兴奋性的关键调节因子，并将它们确定为开发抗癫痫疗法的有前景的细胞靶点。