单细胞测序揭示慢性HIV感染期间NK细胞失调并鉴定与HIV储存库衰减相关的过渡型NK细胞毒性

《eBioMedicine》：Single-cell sequencing reveals NK cell dysregulation during chronic HIV infection and identifies transitional NK cell cytotoxicity related to HIV reservoir decay

　　

背景：自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫系统的组成部分，在对抗病毒感染中发挥关键作用。人类对HIV感染如何影响NK细胞异质性的理解仍有限。方法：研究人员对5名健康对照与17名男性HIV感染者（PLWH）外周血NK细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），覆盖抗逆转录病毒治疗（ART）前后；采用O-link蛋白质组学量化血浆炎症细胞因子；检测CD4+ T细胞相关HIV-DNA。结果：在鉴定的10个NK亚群中，c7-I型干扰素（IFN）应答细胞在未治疗者中升高，与CD4+ T细胞计数负相关、与炎症正相关；c3-CD56dim NK-IRS2亚群（富集脂多糖（LPS）应答基因）在HIV感染后显著下降并发生广泛转录重塑；c8-CD56dim NK-STMN1与c9-CD56dim NK-MKI67两个增殖亚群分别富集于S期与G2/M期且具有不同代谢特征；ART前c5-过渡型NK亚群的细胞毒性评分与随时间HIV-DNA下降相关。解读：研究全面阐明慢性HIV感染中NK细胞免疫应答的细胞和分子异质性，为基于NK细胞的免疫治疗提供依据。

研究背景与立项依据

慢性HIV感染在抗逆转录病毒治疗（ART）下虽可抑制病毒载量至不可检测水平，但持久性HIV储存库仍是实现功能性治愈的主要障碍。自然杀伤（NK）细胞是先天免疫的关键效应细胞，通过激活/抑制受体平衡调控细胞毒性，并分泌β-趋化因子竞争结合CCR5阻断病毒进入。既往研究提示NK细胞活性与疾病进展及储存库衰减存在关联，但HIV感染对NK细胞异质性的单细分辨率刻画不足，PBMC混合测序中NK捕获数有限，无法精细分辨亚群。为阐明ART前后NK亚群动态及其与HIV-DNA衰减的关系，研究人员构建慢性HIV感染外周血NK细胞最大规模无偏单细胞转录组图谱。

论文发表于《eBioMedicine》，队列来源于中国北京解放军总医院第五医学中心，纳入17名男性PLWH（未治疗与ART>1年配对）及5名健康对照（HC），另增5名PLWH与4名HC作功能验证，所有受试者CMV IgG阳性，仅取外周血。

主要关键技术方法

研究人员采用磁性分选富集NK细胞后行10× Genomics固定RNA探针捕获测序（Chromium Fixed RNA Profiling，靶向约18532基因），Seurat质控、Harmony批次校正、UMAP聚类鉴定10亚群；并行O-link炎症面板（92蛋白，NPX单位）定量血浆炎症蛋白；磁分选CD4⁺ T细胞后qPCR测细胞相关HIV-DNA、微滴数字PCR（ddPCR）行完整前病毒DNA检测（IPDA）；流式验证MX1⁺、STMN1⁺、ki67⁺、CD49f⁺等表面/胞内标志；Monocle3拟时间、AUCell功能评分、SCENIC转录因子RSS分析、scMetabolism代谢评分。

研究结果

scRNA-seq profiling of NK cells in PLWH：通过质控保留262697个NK转录组，聚为10亚群（c0–c9）。未治疗者c7-I型IFN应答、c8-STMN1增殖亚群富集，c3-CD56^dim NK-IRS2唯一在未经治与ART后均显著低于HC；ART后c1-CD52、c2-RAP2A适应样亚群回升，证明HIV诱导的NK分布异常不被ART完全逆转。

Functional divergence of NK cell subsets：CD56^dim高表达PRF1/GZM家族，CD56^bright（c6）高GZMK/GNLY但细胞毒性评分低；c5-过渡型表达FCGR3A中等、CCR5特异；伪时间示c6为起点，c5为分叉点走向c4-ZNF331或经c3/c0/c2/c1/c9/c8成熟轴。GO显示c3富集LPS应答、c7富集抗病毒防御。

c7-Type I IFN-responding cells were associated with HIV disease progression：c7比例与血浆CXCL9/10/11、TNF、IL-12B、IL-18、CCL19、TNFRSF9正相关，与CD4计数/CD4:CD8比负相关、与病毒载量正相关；流式MX1⁺NK印证，胞内ISG（IFIT/IFITM/MX1/IFI44L）上调，IL-12/15/18刺激下CD107a、穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ高于MX1^?。

Two proliferating NK cell subsets showed distinct metabolism patterns：c8-STMN1几乎全S期，富集嘧啶代谢、柠檬酸循环、氧化磷酸化；c9-MKI67约60%在G2/M，富集烟酸酰胺与醚脂质代谢；流式仅STMN1⁺频率在感染后升高，ki67⁺无显著变化。

Transcriptional remodelling of NK subsets following HIV infection：c3-IRS2与c4-ZNF331 DEG数最多，c3上调IRS2/JUN/FOS/NFKBIZ及LPS应答，c4高KLRG1/CD160/TIGIT耗竭标志；ART后多数亚群抗病毒通路仍残存激活但较未治减弱，说明ART部分而非完全归一化转录程序。

Unique transcriptomic profile of adaptive-like NK cells：c1-CD52、c2-RAP2A具最高适应样模块分，表达CD52/IL32/CD3E/B3GAT1(CD57)/BCL11B/BATF，缺失FCER1G/SYK/ZBTB16；RSS示BCL11B、GLIS2、SETBP1共有；流式FcεRIγ^?、NKG2C⁺FcεRIγ^?、CD52⁺、CD52⁺NKG2C⁺在cART组高于未治与HC，CMV血清状态与扩增无直线相关。

NK cell cytotoxicity may contribute to the reduction of HIV-DNA：ART前c5-过渡型细胞毒性分与HIV-DNA及完整前病毒fold change显著负相关，PRF1贡献突出；ITGA6(CD49f)为该亚群选择性表面标记，分选CD49f⁺NK验证其中等穿孔素/颗粒酶B、刺激后CD107a高于经典CD56^bright/dim，其穿孔素表达与ART后HIV-DNA衰减负相关。

讨论与结论翻译

讨论指出，慢性HIV致胃肠屏障渗漏使LPS移位持续激活c3-IRS2并不可被ART复原，c4-ZNF331与残留CXCL10/11炎症偶联；c5-过渡型兼具CD56^bright趋化与CD56^dim毒性的中间态，以CD49f为富集标志，其细胞毒性与储存库早期衰减相关但非因果证明；c7-I型IFN应答细胞可能是慢性免疫激活的有害生物标志而非清除证据；适应样NK在cART下扩张且CCL5高表达具竞阻CCR5潜能，但与CMV暴露不可分；两增殖亚群代谢分流（糖酵解vs氧化磷酸化）各具周期适应。局限为单中心、仅男性汉族、外周血、ART约1年、Flex探针非全转录组、缺精英控制者对照。

结论部分：本研究系统阐明慢性HIV感染中NK细胞细胞与分子异质性，建立参照级单细胞图谱；数据提示NK（尤其过渡型与适应样亚群）可能参与ART启动后HIV储存库衰减调制，支持面向NK细胞的免疫治疗方案开发，并需在严谨临床设计中评估其对储存库缩减的影响。