《Horticultural Plant Journal》：MdbZIP45 Positively Regulates Anthocyanin Accumulation Promoted by 5-Aminolevulinic Acid in Apples
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5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是近年来受到关注的一种植物生长调节剂，能够促进苹果中花青苷积累，但其潜在分子机制尚未得到充分解析。因此，阐明ALA调控花青苷积累的分子机制，对于提升苹果果实品质兼具理论意义与实践价值。本研究
5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是近年来受到关注的一种植物生长调节剂，能够促进苹果中花青苷积累，但其潜在分子机制尚未得到充分解析。因此，阐明ALA调控花青苷积累的分子机制，对于提升苹果果实品质兼具理论意义与实践价值。本研究以绿色成熟苹果果实和‘Orin’愈伤组织为实验材料。表达分析显示，在苹果果皮中，经200 mg·L-1 ALA处理48 h内，或在苹果愈伤组织中，经0.25 mg·L-1 ALA处理14 d后，MdbZIP45转录水平均显著上调，并与花青苷积累呈正相关。分子特征分析表明，MdbZIP45编码一个定位于细胞核的蛋白，并含有保守的bZIP结构域。苹果果皮和愈伤组织中的功能分析表明，过表达（overexpressing，OE-）MdbZIP45可上调花青苷生物合成与转运相关基因的表达，并促进花青苷积累，且该效应在ALA存在下进一步增强。相反，RNA干扰（RNA interfering，RNAi-）MdbZIP45会显著抑制相关基因表达及花青苷积累，而外源ALA可减弱这种抑制作用。机制研究表明，MdbZIP45能够特异识别并结合花青苷生物合成与转运基因启动子中的G-box顺式作用元件（cis-element，CACGTG），相关靶基因包括MdCHS、MdUFGT和MdMATE8，以及一个重要的转录因子基因MdWRKY71。荧光素酶（luciferase，LUC）报告实验和β-葡萄糖醛酸苷酶（glucuronidase，GUS）染色进一步证实，MdbZIP45能够增强下游靶基因的转录活性。上述结果表明，MdbZIP45在ALA诱导的花青苷积累过程中具有关键作用，其既可直接调控下游结构基因表达，也可调控转录因子基因表达，后者进一步间接促进苹果花青苷生物合成。这些结果揭示了一种双重调控机制，为理解ALA诱导花青苷积累的分子调控框架提供了新的认识，并为提升果实外观品质提供了潜在策略。
该论文发表于《Horticultural Plant Journal》，围绕苹果着色形成中5-氨基乙酰丙酸（ALA）诱导花青苷积累的分子调控机制展开。苹果果皮红色深浅直接影响商品价值和消费者偏好，而花青苷不仅决定果实外观色泽，还与抗氧化及营养健康属性密切相关。已有研究已经较系统地解析了花青苷生物合成途径及其经典MYB-bHLH-WD40（MBW）调控模块，但ALA如何通过更广泛的转录因子网络促进苹果着色，仍有大量关键节点未被明确。尤其是bZIP转录因子家族虽在光信号、激素反应和次生代谢中发挥重要作用，但其是否参与ALA信号并介导苹果花青苷积累，尚缺乏直接证据。基于此，研究人员聚焦MdbZIP45，系统解析其在ALA促进苹果花青苷积累中的功能及作用路径，最终证明MdbZIP45是ALA响应型关键转录因子，能够通过直接和间接两条途径共同促进花青苷合成与转运，对苹果果实着色调控具有重要理论和应用意义。
在技术方法方面，研究人员以绿色成熟‘Fuji’和‘Shinano-Sweet’苹果果实及稳定转化的‘Orin’苹果愈伤组织为材料，结合ALA外源处理、花青苷含量测定和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析基因表达。通过亚细胞定位明确MdbZIP45的核定位特征，并利用瞬时过表达、RNA干扰（RNAi）及愈伤组织稳定遗传转化评估其生物学功能。进一步结合酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、荧光素酶（LUC）报告和β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）报告体系，验证MdbZIP45与下游靶基因启动子的结合及转录激活关系。
在研究结果部分，论文首先保留并展开各小节结论如下。
3.1. Analysis of phylogenetic tree, gene promoters and conserved motifs of MdbZIP family
研究人员首先对苹果MdbZIP家族开展系统发育分析，并与拟南芥bZIP家族成员比较，发现苹果与拟南芥共190个bZIP成员可分为14个亚家族，其中S亚家族成员最多。由于已有研究提示S亚家族成员与花青苷积累相关，研究人员进一步聚焦该亚家族。系统发育分析显示，MdbZIP45与MdbZIP44、MdbZIP90及AtbZIP4亲缘关系较近。启动子顺式元件分析表明，MdbZIP45启动子富含光响应元件。蛋白序列比对和保守基序分析进一步证明，MdbZIP45具有典型bZIP蛋白特征，包括碱性DNA结合区和亮氨酸拉链二聚化区，说明其具备作为转录因子的结构基础。
3.2. ALA upregulates MdbZIP45 expression in induction of fruit coloration
在外源ALA处理苹果果实后，研究人员观察到果皮着色在48 h和72 h显著增强，花青苷含量同步升高。RT-qPCR筛选显示，S亚家族中仅少数成员对ALA有稳定响应，其中MdbZIP45表达显著上调，并与花青苷积累变化相一致。随后通过ProMdbZIP45-GUS瞬时表达分析，证实ALA能够增强MdbZIP45启动子活性。亚细胞定位实验显示，MdbZIP45-GFP融合蛋白特异定位于细胞核，符合其转录调控功能。该部分结果表明，MdbZIP45是ALA诱导苹果着色过程中被激活的核定位转录因子。
3.3. MdbZIP45 positively regulates anthocyanin biosynthesis in apple fruits
为明确MdbZIP45的功能，研究人员在‘Shinano-Sweet’苹果果皮中进行农杆菌介导的瞬时过表达和RNAi沉默实验。结果显示，过表达MdbZIP45显著增强注射区域红色着色并提高花青苷含量，而RNAi沉默则导致果皮着色减弱、花青苷含量下降。分子检测进一步显示，MdbZIP45过表达可显著上调MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT、MdMATE8和MdGSTF12等花青苷生物合成及转运相关基因，而沉默MdbZIP45则抑制这些基因表达。因此，MdbZIP45在苹果果实中表现为花青苷积累的正调控因子。
3.4. ALA-induced MdbZIP45 positively regulates anthocyanin biosynthesis in apple callus
在稳定遗传转化的‘Orin’苹果愈伤组织中，研究人员进一步验证MdbZIP45在ALA诱导体系中的作用。表型上，OE-MdbZIP45愈伤组织着色明显强于野生型（WT），RNAi-MdbZIP45则几乎不着色；ALA处理后，三种基因型的着色均增强，但过表达材料表现最强。花青苷定量结果与表型一致。基因表达分析表明，MdbZIP45及MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT、MdMATE8、MdGSTF12等关键基因在过表达材料中显著升高，在RNAi材料中受到抑制。特别是ALA对大多数基因具有促进效应，但MdUFGT在RNAi背景下受抑明显且难以被ALA恢复，说明MdbZIP45在ALA诱导花青苷积累中具有必要性并位于相关结构基因上游。
3.5. MdbZIP45 activates transcription of MdCHS, MdUFGT and MdMATE8 by binding to the promoters
基于前述结构基因表达变化，研究人员通过酵母单杂交筛查MdbZIP45的直接靶标。结果发现，MdbZIP45可与MdCHS、MdUFGT和MdMATE8启动子互作，而不与MdF3H、MdDFR、MdANS和MdGSTF12启动子直接结合。启动子分析显示，这3个靶基因均含有G-box元件。EMSA进一步证实，MdbZIP45能够特异识别并结合这些G-box序列，竞争探针削弱结合，突变探针则消除结合信号。LUC和GUS报告实验进一步证明，MdbZIP45显著增强MdCHS、MdUFGT和MdMATE8启动子的转录活性。由此可见，MdbZIP45可通过直接激活花青苷生物合成基因和转运基因来促进色素积累。
3.6. MdbZIP45 promotes the expression of other transcription factor genes in ALA-induced anthocyanin accumulation
除结构基因外，研究人员还考察了多个已报道参与ALA诱导花青苷积累的转录因子。结果显示，在果皮瞬时过表达MdbZIP45后，MdMYB1、MdMYB9、MdMYB10、MdMYB110a、MdbHLH3、MdNAC33、MdMADS1、MdERF78、MdHsfB3a和MdWRKY71等表达升高，而MdbHLH33、MdTTG1和MdWD40-280下降；在RNAi背景下，上述检测基因整体下调。愈伤组织中进一步分析表明，ALA能进一步促进部分基因表达，但对MdMYB10和MdbHLH3在OE-MdbZIP45中的变化并不一致。该结果提示，MdbZIP45对ALA诱导花青苷积累的调控并不主要依赖经典MBW主通路，而可能更多通过非MBW分支发挥作用。
3.7. MdbZIP45 binds to the promoter of MdWRKY71 to positively regulate the gene transcription
在多个受影响的转录因子中，酵母单杂交结果显示MdbZIP45仅能直接结合MdWRKY71启动子。由于其启动子中含有4个G-box元件，研究人员进一步采用EMSA验证，证实MdbZIP45可分别结合这些位点，且结合依赖完整CACGTG序列。LUC与GUS实验显示，MdbZIP45可显著增强MdWRKY71启动子活性和报告基因表达。结合已有研究中MdWRKY71可激活MdDFR和MdANS的证据，说明MdbZIP45不仅可直接调控结构基因，还可通过激活MdWRKY71这一转录因子间接放大花青苷生物合成信号。
在讨论部分，论文重点指出ALA诱导苹果花青苷积累涉及复杂而多分支的转录调控网络。研究人员将MdbZIP45定位为该网络中的关键bZIP成员，补充了以往主要围绕MBW复合体、MdMADS1、MdERF78、MdNAC33和MdWRKY71等因子构建的调控框架。文章还对苹果bZIP成员命名混乱问题进行了梳理，强调准确基因命名对于功能研究的重要性。更重要的是，研究结果表明MdbZIP45兼具双重调控特征：一方面直接结合MdCHS、MdUFGT和MdMATE8启动子，促进花青苷生物合成与液泡转运；另一方面直接激活MdWRKY71表达，再由后者促进MdDFR和MdANS等下游基因转录，从而形成直接路径与间接路径并行的分叉式调控模式。这一发现拓展了对ALA诱导苹果着色分子机制的理解，也揭示了bZIP家族在植物次生代谢中的新作用。
研究结论部分可译为：本研究表明，MdbZIP45是ALA促进苹果花青苷积累过程中的关键调控因子。结果显示，外源ALA处理可显著诱导MdbZIP45表达，随后MdbZIP45直接激活花青苷生物合成与转运基因MdCHS、MdUFGT和MdMATE8的转录。同时，MdbZIP45还能够激活MdWRKY71启动子，从而增强其对下游基因MdDFR和MdANS的转录调控作用，协同促进苹果花青苷合成与积累。总体而言，该研究进一步深化了对ALA调控苹果花青苷积累分子机制的认识。
