Virulence | 李庆阁教授团队成功开发鼠疫菌现场监测平台——手臂PCR技术助力资源有限地区精准监测

　　

鼠疫，这一曾改写人类历史进程的烈性传染病，至今仍在全球多个自然疫源地持续威胁公共卫生安全。我国将其列为甲类传染病之首，俗称“一号病”。精准防控鼠疫的关键，在于对病原体——鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）——实现分型进而快速追溯其源头。然而，现有分型技术长期依赖细菌培养与全基因组测序，对实验条件和专业人员要求极高，难以在偏远、资源有限的野外监测站开展。加之鼠疫耶尔森菌具有高传染性、高病死率及潜在生物恐怖威胁，被世界卫生组织列为优先管控烈性病原体，分型技术的现场化滞后问题更显突出。

2021年，国家重点研发计划“鼠疫检测试剂标准化与评价及溯源技术研究”获批立项；2022年，内蒙古自治区“鼠疫防控关键技术研究”重大专项同步启动。两个项目的分型技术研究均由我校分子诊断教育部工程研究中心承担。在李庆阁教授带领下，中心联合中国疾控中心、军事医学科学院和内蒙古自治区疾控中心，成功开发出可部署于现场的鼠疫耶尔森菌分型技术。相关成果以“A field-deployable high-resolution SNP genotyping platform for rapid surveillance of Yersinia pestis”为题，发表于国际期刊Virulence。该研究将团队自主研发的ARMS-HANDS PCR（手臂PCR）技术与多色熔解曲线分析相结合，构建了一套可在野外现场部署的高分辨率SNP基因分型平台，实现从样本上机到结果输出的全流程自动化，为鼠疫现场快速分型和精准监测提供了全新技术手段。

技术方案：三管反应锁定全球24个谱系与9个内蒙古优势亚谱系

研究团队基于前期对3000余株鼠疫菌基因组的大数据分析，筛选出37个标志性SNP位点（canSNP）：25个用于区分全球24个主要谱系，12个用于解析内蒙古地区流行的9个优势亚谱系。这些位点经严格验证，具有进化稳定性高、信息冗余度低、便于引物设计等特点。

在此基础上，团队将ARMS-HANDS PCR与多色熔解曲线分析技术整合，设计了封闭式多重SNP基因分型体系。该技术通过“通用尾巴引物”启动不对称扩增，并且让引物二聚体产生锅柄结构有效抑制多重反应中的引物二聚体形成；扩增产物与自淬灭探针解离后，在不同荧光通道中产生特征性熔解峰，通过熔解温度差异即可判读SNP基因型。整个反应在封闭管中2小时内完成，无需任何后PCR开盖操作，为现场部署奠定了基础。方法学性能评价显示，该平台技术参数优异：检测限低至50个基因组拷贝/反应，较传统分型方法所需的纳克级DNA投入量降低数个数量级；熔解温度（Tm）重复性良好（标准差0.051–0.407℃），相邻熔解峰无交叉干扰；对假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌等近缘种无交叉反应，特异性可靠。

实战验证：草原上的“样本进—结果出”

为验证监测体系的准确性，研究团队采用双盲设计，对166株经全基因组测序预分型的鼠疫菌DNA样本进行测试。结果显示基因分型准确率达100%，与全基因组测序结果完全一致，涵盖17个全球谱系及内蒙古地区全部优势亚谱系。

进一步地，研究团队将该平台集成至名为Sanity 2.0的便携式“样本进—结果出”设备，直接应用于内蒙古鄂托克旗鼠疫野外监测站采集的感染长爪沙鼠肝脏样本（图1A）。从样本处理到获得最终分型结果，全程仅需约120分钟（图1B）。9份野外样本均准确鉴定为2.MED3谱系下的2.MED3.1.4亚谱系——这与该地区1948–2021年间2.MED3.1.2和2.MED3.1.4为优势流行亚谱系的流行病学数据高度吻合（图1C）。同时，该结果与实时荧光PCR仪的验证结果完全一致，充分验证了平台在现场条件下的可靠性与实用性。

图：受感染的蒙古长爪沙鼠肝脏中鼠疫耶尔森菌的分型及其地理背景。（A）中国内蒙古自治区高、中、低风险行政区域内59个鼠疫野外监测站的地理分布，以及本研究分析的9份蒙古沙鼠肝脏标本的采样点位置。风险等级按行政区域以色标标示，图中标注了相邻省份及国际边界以供空间参考。地理空间数据来源于国家基础地理信息中心（https://www.tianditu.gov.cn/）。（B）直接从长爪沙鼠肝脏标本中进行鼠疫耶尔森菌分型的实验流程。（C）5号样本的MMCA实验代表性结果。NTC：无模板对照；MMCA：多色熔解曲线分析。

该研究将基础研究与公共卫生实践紧密结合，验证了ARMS-HANDS PCR与多色熔解曲线分析技术在临床及现场检测中的潜力，是科研团队面向国家重大需求、开展现场检测技术研究的生动实践。未来，随着该平台的进一步优化与推广，更多精准检测技术有望应用于野外和边疆地区，为守护人民健康与生物安全提供坚实支撑。

该论文的共同第一作者为厦门大学化学化工学院博士后刘颖、厦门大学生命科学学院副教授黄秋英和军事医学科学院博士后武雅蓉（已入职天津大学）；共同通讯作者为厦门大学生命科学学院李庆阁教授和军事医学科学院崔玉军研究员。该研究获得国家重点研发计划、内蒙古自治区科技重大专项和厦门市重大科技项目资助。

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42418343/.

（图/文 李庆阁团队）