YZG-331通过Mg2+依赖性阻断N-甲基-D-天冬氨酸受体发挥术后认知功能障碍神经保护作用

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Neuroprotection by YZG-331 in postoperative cognitive dysfunction via Mg2+-dependent blockade of NMDA receptors

　　

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一种发生于手术后的致残性神经系统并发症，目前尚无有效干预措施。研究人员鉴定出YZG-331这一新型腺苷类似物（adenosine analog）具有良好前景的神经保护作用，能够在小鼠POCD模型中改善认知缺陷并减轻树突棘丢失。整合蛋白质组学分析（proteomic profiling）与生物信息学通路分析显示，YZG-331选择性靶向N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）信号通路。电生理记录与活细胞钙成像表明，YZG-331以剂量依赖性方式抑制NMDAR介导的电流及Ca²⁺内流。进一步研究显示，YZG-331抑制NMDAR活性需要Mg²⁺参与。YZG-331在Mg²⁺存在条件下破坏NMDAR凝聚体（condensates）的形成，从而减弱NMDAR介导的兴奋性毒性（excitotoxicity）。上述发现确立了YZG-331作为POCD潜在治疗候选药物的地位，并揭示了Mg²⁺依赖性受体调节作为靶向NMDAR相关神经病理的新型药理学策略。

该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，围绕术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）缺乏有效药物干预这一临床难题，系统评估了新型腺苷类似物YZG-331的神经保护作用及其分子机制。POCD是围手术期医学中的重要并发症，主要表现为注意、记忆、语言及社会功能障碍，既延缓术后恢复，也会加速远期认知衰退。现有研究提示，POCD的发生与神经炎症、谷氨酸毒性、突触损伤以及N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）功能异常密切相关。其中，NMDAR过度激活引发Ca²⁺超载，进而诱发线粒体损伤、氧化应激和突触丢失，被认为是手术打击与认知障碍之间的关键病理连接环节。然而，针对这一通路的精准药理学干预仍较为缺乏，因此开展相关研究具有明确的理论价值和临床意义。

研究人员基于既往关于YZG-331中枢药效学特征的研究基础，提出其可能通过调节谷氨酸兴奋性传递而缓解POCD。为验证这一假设，研究人员首先在右侧颈总动脉暴露联合七氟醚麻醉的小鼠模型中评价YZG-331对行为学和神经结构学损伤的影响，随后进一步结合原代皮层神经元谷氨酸兴奋性毒性模型、蛋白质组学分析、膜片钳电生理、钙成像、HEK293T异源表达体系及光遗传凝聚实验，逐层解析其作用靶点和机制。结果表明，YZG-331可显著改善麻醉/手术诱导的认知缺陷，恢复皮层和海马神经元树突棘密度与树突复杂度，并通过Mg²⁺依赖性增强NMDAR阻断而减少Ca²⁺内流和兴奋性毒性损伤。研究最终将YZG-331界定为一种具有围手术期神经保护潜力的新型NMDAR调节剂。

研究采用的主要关键技术方法包括：建立C57BL/6J雄性小鼠右侧颈总动脉暴露联合七氟醚麻醉POCD模型，并通过新物体识别、情景恐惧条件反射及旷场实验评估认知与行为；采用Golgi-Cox染色评价前额叶和海马CA1区树突棘及树突分支结构；在原代皮层神经元和HEK293T细胞中结合扫描电镜、透射电镜、多电极阵列（MEA）、全细胞膜片钳、海马脑片电生理、Fura-2 AM钙成像、TMT标记定量蛋白质组学及光诱导相分离实验解析受体功能与分子机制。动物样本来源为8周龄雄性C57BL/6J小鼠，脑片实验使用14日龄雄性C57BL/6J小鼠，体外神经元来源于小鼠胎鼠皮层。

3.1. YZG-331 ameliorates cognitive deficits in anesthesia/surgery mice.
研究人员首先验证了YZG-331对POCD样行为异常的改善作用。采用右侧颈总动脉暴露联合麻醉建立模型后，新物体识别实验显示，麻醉/手术显著降低识别指数和分辨指数，提示非空间学习记忆受损；40和80 mg/kg的YZG-331能够显著逆转上述缺陷，而单独给药对正常对照动物无明显影响。情景恐惧条件反射实验进一步显示，麻醉/手术后小鼠在训练后1 h和24 h均出现明显记忆受损，YZG-331同样可显著改善短时程和长时程记忆表现。旷场实验未见各组自主活动及焦虑样行为差异，说明YZG-331对认知改善并非源于运动能力变化。该部分结果表明，YZG-331能够特异性对抗麻醉/手术诱导的认知和情绪记忆障碍。

3.2. YZG-331 restored synaptic morphology in anesthesia/surgery mice and attenuates glutamate-induced neuronal morphological alterations
在明确行为学效应后，研究人员进一步考察其对神经元结构可塑性的影响。Golgi染色结果显示，麻醉/手术导致前额叶皮层和海马CA1区锥体神经元树突棘密度显著下降，同时Sholl分析显示树突分支复杂度和交叉数减少，提示突触结构和树突骨架受损。YZG-331处理后，皮层和海马神经元的树突棘密度均得到恢复，树突分支长度和复杂性亦明显改善。该结果说明，YZG-331具有稳定突触结构、逆转树突萎缩的神经保护作用，且这种结构性修复与前述认知获益相一致。

3.3. YZG-331 attenuates glutamate-induced neuronal morphological and functional alterations by suppressing excitability in cortical neurons
3.3.1. YZG-331 attenuated glutamate-induced morphological alterations
为建立与POCD相关的细胞学病理联系，研究人员采用谷氨酸诱导原代皮层神经元兴奋性毒性模型。扫描电镜显示，谷氨酸处理24 h可导致神经元胞体缩小、树突复杂度降低；透射电镜进一步显示线粒体肿胀、嵴结构丢失、膜破裂及空泡样改变。YZG-331共处理后，上述神经元形态与线粒体超微结构损伤均明显减轻。该结果表明，YZG-331能够在细胞层面抵御谷氨酸兴奋性毒性所致的神经元结构破坏。

3.3.2. YZG-331 mitigates glutamate-induced impairment of cortical neuronal function
在功能层面，多电极阵列记录表明，对照培养神经元可形成稳定的自发放电网络，而谷氨酸暴露显著抑制同步放电模式并降低平均放电频率。YZG-331可部分恢复受损的网络活动，且24 h后恢复更为明显。进一步的电流钳记录显示，YZG-331可浓度依赖性抑制去极化诱发动作电位频率，提示其还能直接降低神经元固有兴奋性。该部分结果说明，YZG-331一方面缓解谷氨酸导致的网络失同步，另一方面抑制神经元过度兴奋，从而形成双重神经保护效应。

3.4. Proteomic profiling reveals YZG-331-mediated neuroprotection via NMDA receptor modulation.
为筛选YZG-331的关键作用通路，研究人员对对照组、谷氨酸组及YZG-331+谷氨酸组原代皮层神经元进行了TMT定量蛋白质组学分析，共鉴定5059种蛋白。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示各组可明显区分。差异蛋白及共调控蛋白的KEGG和GO富集分析均指向谷氨酸能突触及NMDAR复合体相关通路，提示NMDAR可能是YZG-331发挥保护作用的核心靶点。进一步Western blot结果显示，麻醉/手术模型小鼠皮层中GLUN1、GLUN2A、GLUN2B及GLUA2表达上调，PSD95表达下调；YZG-331可显著逆转GLUN2A和GLUN2B的升高。该部分从蛋白表达谱层面将YZG-331的作用机制聚焦于NMDAR调节。

3.5. YZG-331 attenuates glutamate-induced calcium dysregulation via NMDAR modulation
3.5.1. Calcium imaging reveals NMDAR subtype of iGluR inhibition by YZG-331
研究人员采用Fura-2 AM钙成像对功能靶点进行验证。结果显示，YZG-331可剂量依赖性抑制谷氨酸诱导的胞内Ca²⁺升高，也可强效抑制NMDA诱导的Ca²⁺超载。全细胞膜片钳实验进一步证实，YZG-331可剂量依赖性抑制皮层神经元NMDAR电流，在50 μmol/L时电流下降约67%。在海马脑片中，YZG-331还可抑制NMDAR介导的兴奋性突触后电流（NMDAR-eEPSCs）幅度。综合钙成像与电生理结果，研究人员确认YZG-331主要通过抑制NMDAR功能而维持神经元钙稳态。

3.5.2. YZG-331 suppresses AMPA/KA receptor-mediated calcium influx through NMDARs
进一步研究探讨YZG-331对其他离子型谷氨酸受体介导Ca²⁺信号的影响。结果显示，YZG-331也可抑制AMPA和海人酸（kainate，KA）诱导的Ca²⁺升高；但在无Mg²⁺条件下，这一抑制作用消失。同时，加入NMDAR拮抗剂APV后，AMPA/KA诱发的Ca²⁺内流在YZG-331存在时被消除。研究人员随后在HEK293T细胞异源表达GLUA1/GLUA2受体，发现YZG-331既不改变谷氨酸或AMPA诱导Ca²⁺反应，也不影响GLUA2电流幅度及去敏化动力学。由此可见，YZG-331并非直接作用于AMPAR，而是通过NMDAR依赖机制间接影响AMPA/KA相关Ca²⁺信号。

3.6. YZG-331 potentiates Mg²⁺ blockade of NMDAR
该研究最核心的机制发现集中于Mg²⁺依赖性调节。研究人员发现，Mg²⁺本身可浓度依赖性抑制NMDA诱导的Ca²⁺升高；而在无Mg²⁺环境中，YZG-331完全失去对NMDA反应的抑制能力。随着胞外Mg²⁺浓度升高，YZG-331对NMDAR反应的抑制逐渐增强，并显著左移Mg²⁺的剂量-反应曲线，使Mg²⁺抑制NMDAR的效力大幅提高。该结果提示YZG-331不是传统意义上的直接通道阻断剂，而是Mg²⁺阻断效能的增强剂。

为进一步确认这一机制，研究人员在HEK293T细胞中共表达GLUN1/GLUN2A/PSD95或GLUN1/GLUN2B/PSD95重组受体。结果显示，在无Mg²⁺条件下，YZG-331对NMDA诱导的Ca²⁺反应和NMDAR电流均无抑制作用；在存在Mg²⁺时，其抑制作用则十分显著。进一步的光遗传聚集实验利用GLUN2A羧基末端结构域（C-terminal domain，CTD）与PSD95重建受体凝聚过程，结果表明，YZG-331在Mg²⁺存在时可减少GLUN2A-CTD/PSD95形成的大分子凝聚体数量。该发现说明，YZG-331不仅增强Mg²⁺对NMDAR通道的阻断，还可能干扰NMDAR相关突触纳米结构组装，从而减弱受体介导的兴奋性毒性。

讨论部分指出，POCD目前缺乏有效防治药物，而该研究证明YZG-331能够同时改善行为学认知损害和突触结构损伤，提示突触重塑可作为POCD干预的重要治疗靶点。机制上，YZG-331通过调节NMDAR功能、减轻谷氨酸兴奋性毒性、维持线粒体完整性和神经元钙稳态，实现对皮层和海马突触结构的保护。尤其重要的是，YZG-331通过增强内源性Mg²⁺对NMDAR的阻断作用发挥效应，这一机制区别于传统NMDAR拮抗剂，具有更强的生理适配性和潜在安全优势。研究同时指出，YZG-331对GLUN2A/GLUN2B表达恢复及其对NMDAR-PSD95凝聚行为的影响，提示其作用可能不仅限于通道阻断，还涉及受体组装与突触定位调节。作者也在文中明确提出，YZG-331、Mg²⁺与NMDAR亚基间更精确的结构互作关系，以及相关翻译后修饰机制，仍需后续研究。

研究结论部分可译为：本研究鉴定出YZG-331是一种新型药理学活性分子，可与内源性Mg²⁺协同减轻NMDAR过度激活，从而降低突触损伤。其增强镁阻断作用并恢复突触结构的能力，使YZG-331成为POCD及相关神经认知障碍极具开创性的治疗候选药物。对NMDAR–Mg²⁺–YZG-331相互作用调控机制的认识，将为靶向兴奋性毒性相关病理中的NMDAR与镁相互作用开辟新的研究与治疗方向。