双芳基肽（biarylitide）是一类由细菌核糖体合成并经翻译后修饰的肽类（RiPPs），其含有一个由专用细胞色素P450酶形成的双芳基桥，可引入不同交联键。双芳基肽经由一个五氨基酸前体肽产生，该前体由最小18 bp基因编码，可规避自动检测。既往针对双芳基肽的基因组挖掘方法未能覆盖其完整生物合成空间。研究人员因而改造了一种机器学习算法，全面绘制双芳litide的生物合成空间，涵盖前体基序、P450及附加修饰酶的变异，由此获得277个双芳基肽生物合成基因簇（BGCs）。研究人员以先前未研究的核肽基序（包括YWH、YVH和YWY）实验探究了双芳基形成，并阐明了这些交联的性质。本研究显著拓展了双芳基肽前体及BGC多样性，并为系统探索其他RiPP家族提供方向。

《JACS Au》：A Machine Learning-Based Genome Mining Approach Reveals Unprecedented Biarylitide Diversity

　　

双芳基肽（biarylitides）是一类细菌核糖体合成并翻译后修饰肽（RiPPs），含有由专用细胞色素P450（P450）酶形成的双芳基桥，可引入不同交联。双芳基肽由五氨基酸前体肽经最小18 bp基因编码产生，规避自动检测。既往双芳基肽基因组挖掘未覆盖其完整生物合成空间。研究人员改造机器学习算法，全面绘制双芳基肽生物合成空间，包括前体基序、P450及附加修饰酶变异，获得277个双芳基肽生物合成基因簇（BGCs）。研究人员以先前未探究的核肽基序（YWH、YVH、YWY）实验研究双芳基形成并阐明交联性质。该研究显著拓展双芳基肽前体与BGC多样性，为系统探索其他RiPP家族提供方向。

研究背景与问题提出：双芳基肽（biarylitides）属于核糖体合成并翻译后修饰肽（RiPPs）中由细胞色素P450（P450）介导侧链交联的三肽亚类，其前体肽仅五氨基酸（leader 2 aa + core 3 aa），编码基因仅18 bp，是已知最小的RiPP前体及生命树中最小基因，传统BLAST/PSI-BLAST与现有基因注释流程均难以捕获。既往挖掘依赖bytA与bytO紧邻共定位假设，导致大量非典型架构簇遗漏。论文发表于《JACS Au》，研究人员旨在突破序列相似度限制，重编程机器学习流程以全景绘制双芳基肽生物合成空间。

主要关键技术方法：研究人员改造原用于atropopeptide挖掘的AtropoFinder随机森林分类器（BiarylitideFinder），以106条正样本（实验验证+文献预测P450）与9761条负样本（MIBiG、atropopeptide P450、antiSMASH P450等）训练，对NCBI GenPept中300–500 aa细菌P450扫描；同步改写CoreFinder在P450上下游3 kb内识别5–8 aa、第3与第5位为芳香族的前体ORF；命中簇再用RODEO2做Pfam结构域注释以判读共编码修饰酶；实验端采用大肠杆菌异源表达P450+氧化还原伴侣（PuR/PuxB_A105V）进行体外环化，结合LC-MS、氘代探针、一维/二维NMR（¹H/¹³C/¹⁵N-HSQC、HMBC、ROESY）及链霉菌（Streptomyces coelicolor）异源簇表达验证。样本队列来自NCBI数据库计算扫描与三株放线菌（Actinomadura hibisca、Actinocatenispora rupis、Saccharothrix variisporea）及文献簇。

研究结果：

Bioinformatic Discovery of a Novel Subgroup within the Biarylitide Family：手动分析发现Stackebrandtia nassauensis中bytO下游约1400 bp处才出现MRYWY前体，打破bytA-bytO紧邻范式，催生ML重挖掘。

Machine-Learning-Based Genome Mining of Biarylitides：BiarylitideFinder在GenPept获1128条候选P450，去重人工校订得277个唯一BGC（124个新颖），分布跨越放线菌门、芽孢杆菌门、假单胞菌门，首次在人类口腔/呼吸道微生物Rothia dentocariosa与Rothia sp. HMSC058E10中发现MQYAH潜在产能；鉴定出含色氨酸交联位点的新基序（MKYLW、MQWNY等），Lysinibacillus单株含最多6拷贝bytA；47个BGC共编码Pgm1连接酶与P4-Asp基序，硝基酪氨酸相关簇与一氧化氮合酶共聚类。

Experimental Validation of P450 Enzyme Cross-Links：

MKYWH Motif：Actinomadura hibisca的AchB对Nle-KYWH体外转化率70%，NMR确证为Tyr₃-C6→His-N(τ) C–N交联；P4位仅容忍大疏水残基（W最优，L/V/Y次之），P5换Y/W几乎失活，显示酶高度专一。

MRYWY Motif：Actinocatenispora rupis的AciB作用于Nle-RYWY生成?2 Da单产物，氘代Tyr探针锁定Tyr₃-C–Tyr₅-C C–C键；AciB对P4宽容度高（W以外转换率更高），且不装Y–H键但可接受P5-Trp（AciB达100%双产物）；Streptomyces lydicamycinicus的SlyP同样催化Y₃–Y₅ C–C键且P4宽容。

MRYVH Motif：Saccharothrix variisporea sav簇（含amidinotransferase savT与β-羟化酶savH）在变铅青链霉菌异源表达仅积累未修饰YVH（5），NMR与氘代实验证SavB装Tyr₃-C–His-C C–C键（Tyr C6 δ_C 110.6 ppm），该产物在抗菌/抗真菌/细胞毒 assay无活性。

讨论与结论翻译：研究人员通过ML与实验耦合，将双芳基肽BGC由既往百余扩至277个，把生产者边界推至人类微生物组Rothia；揭示色氨酸进交联位点的新基序、Lysinibacillus多拷贝前体、Pgm1/磺基转移酶/硝基酪氨酸模块与特定前体共演化；结构实验厘清YxH（C–N或C–C视P450而定）、YxY（C–C）两类交联的化学边界与P4空间容限规律。结论指出，改造的AtropoFinder衍生流程能捕获非紧邻架构与极短ORF，所绘系统发育与底物姿态模型为未来Tripeptide P450区域选择性机制研究提供靶标群；双芳基肽虽暂未显经典抗菌活性，但其作为芳基霉素类等外接肽砌块、硝基酪氨酸供体及跨界微生物化学通讯候选的功能谱系由此显著拓宽。