(杂)芳基基序的动力学：研究宏环构象景观的综合方法

《Journal of the American Chemical Society》：Dynamics of (Hetero)aryl Motifs: An Integrative Approach To Study the Conformational Landscape in Macrocycles

　　

宏环肽正成为一种强大的治疗模式，因其潜在的口服生物利用度和能力作用于长期被认为不可成药的靶点。将芳香杂环引入宏环进一步扩展了这一结构空间，赋予独特的构象偏好。然而，准确确定所得分子的溶液态结构和动力学仍然具有挑战性。在本研究中，研究人员整合互补的各向同性和各向异性NMR可观测参数，与增强采样模拟和密度泛函理论(DFT)计算，系统性地研究了含芳基和杂联芳基的环肽在不同溶剂系统中的构象行为。基于残差异偶耦合(RDC)测量的结果揭示了宏环的构象动力学，并通过更真实地捕获溶液态集合，显著扩展了基于核欧氏效应(NOE)的传统NMR分析所获得的知识。该方法能够在NMR时间尺度上的快速和慢速交换区域进行构象分析。值得注意的是，在DFT水平上，每个环系统需要多达三个相互转换的主链构象体才能完全与实验数据吻合。研究人员将芳基和杂联芳基基序识别为控制系统中构象景观的结构元件，调节多个热力学可及状态（以不同的分子内氢键网络和非寻常主链几何为特征）的群体。总之，这一综合NMR计算框架为解决宏环的复杂构象集合提供了精确且通用的策略，应为合成修饰的目标提供信息，并为下一代肽治疗药物的基于结构的合理设计铺平道路。

**论文解读**

**研究背景**
宏环肽因其潜在的口服生物利用度和作用于传统小分子难以靶向的蛋白质-蛋白质相互作用的能力，正成为一类重要的治疗药物。将芳香杂环（如芳基和杂联芳基）引入肽主链可进一步扩展构象和化学空间，增加刚性并提供独特的氢键能力。然而，准确表征这些分子在溶液中的动态构象仍面临巨大挑战。传统方法主要依赖各向同性NMR可观测参数（如核欧氏效应(NOE)和旋转坐标系欧氏效应(ROE)）结合分子动力学(MD)模拟，但标准力场对非标准杂环的参量化不足，且基于NOE的约束仅报告时间平均距离，对于柔性系统可能收敛于单一虚假中间态，无法反映热力学可及的多种构象体。此外，所谓的“活性悬崖”（即微小化学修饰导致活性或渗透性大幅下降）在结构数据稀疏或使用低分辨率结构优化时难以合理化。因此，需要更精确的方法来解析宏环的构象动力学，以指导基于结构的合理设计。

**研究内容与结论**
研究人员开展了一项综合研究，整合各向同性和各向异性NMR可观测参数（包括化学位移、标量耦合、ROE距离、残差异偶耦合(RDC)）与增强采样模拟（CREST）和密度泛函理论(DFT)优化，系统性地分析了八个含芳基或杂联芳基主链的环肽（CP1–CP8）在极性溶剂（甲醇和DMSO）中的构象景观。研究发现，所有八个环肽的最佳描述不是单一静态结构，而是由最多三个构象体组成的动态集合，且这些集合与实验数据高度一致（低AIC值和Cornilescu Q因子）。该研究揭示了芳基和杂联芳基基序是控制构象景观的关键结构元件，它们调节多个热力学可及状态（具有不同分子内氢键网络和非寻常主链几何）的群体。此外，在芳基连接的环肽中发现了快速顺反脯氨酸异构化（相比经典肽显著加速），并通过DFT计算解释了其机制（芳基连接降低异构化能垒）。通过主成分分析(PCA)发现，主链连接类型主导全局构象偏好，而氨基酸序列和溶剂环境仅起次要作用。对于表现出慢速和快速交换共存现象的CP7，研究人员结合元动力学模拟，成功解析了其多时间尺度动力学，自由能景观与NMR实验观察一致。该研究发表于《Journal of the American Chemical Society》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用了8个先前报道的环肽样本（CP1–CP5为杂联芳基，CP6–CP8为芳基，含不同序列和连接基团）。主要技术方法包括：1) 各向同性NMR测量（¹³C化学位移、³J_NH-Hα耦合、ROE距离）和各向异性NMR测量（¹D_CH-RDC）在AAKLVFF或OPA取向介质中进行；2) 增强采样（CREST）和DFT优化（CENSO）生成构象池；3) 使用Stereofitter基于Akaike信息准则(AIC)进行多构象体拟合；4) 变温NMR确定酰胺质子温度系数；5) 过渡态DFT计算（NEB-CI）和显式溶剂元动力学模拟（GROMACS/Plumed）用于动力学解释。

**研究结果**

**Rationale for the Selection of Heterocyclic Peptides for NMR Analysis**
通过对8个环肽的系统选择，研究人员将氨基酸序列和连接基团的影响分离。例如，CP1和CP2共享相同杂联芳基连接但序列不同，以评估侧链影响；CP1和CP3–CP5保持序列相同但改变杂联芳基连接，以隔离主链杂环基团的影响。CP6和CP7（仅差一个残基Pro vs Ile）表现出显著不同的NMR行为（CP7显示多组信号，表明慢速交换），而CP8评估苯胺连接的影响。所有肽溶于DMSO，仅杂联芳基肽溶于甲醇。

**Integrative NMR/DFT Workflow for Ensemble Conformational Analysis Using Isotropic and Anisotropic NMR Parameters**
通过统一DFT框架，整合¹³C化学位移、³J_NH-Hα耦合、ROE距离和¹D_CH-RDC，使用AIC进行构象体选择。发现¹H化学位移因隐式溶剂DFT精度不足而被排除。所有八个环肽的最佳描述为最多三个构象体的集合，且RDC对最终集合的选择起主导作用。不同取向介质和溶剂产生的RDC数据拟合质量相当。

**Conformational Analysis of CP1: Ensemble vs Single State**
对CP1的详细分析显示，先前的ROE/MD单结构模型AIC为215，而最佳单构象体降至113，两构象体AIC降至39，三构象体为33，更多构象体无改善。PCA分析表明，ROE/MD结构位于DFT最小能量区域之外，可能代表高能中间态。NMR/DFT集合通过三个相互转换的构象体（群体50%、34%、16%）分布了所有实验指示的氢键（包括γ-转角、β-转角等），而单一构象体无法同时满足全部氢键模式。温度系数分析支持了该集合的合理性。

**Fast cis/trans-Proline Isomerization in Aryl-Linked CP Series**
对芳基连接肽CP6和CP8的分析揭示，两者需要顺式和反式脯氨酸两态集合（AIC从155降至18，742降至22），且仅观察到一个信号组，表明快速交换。引入侧链RDC未降低拟合质量。Cβ/Cγ化学位移差在宏环中失去诊断力。DFT过渡态计算表明，芳基连接通过增加电子离域和地面态位阻，显著降低顺反异构化能垒（ΔG^?_trans-cis），解释快速交换。

**Backbone Linkage Identity Dominates Conformational Preferences**
通过PCA对所有五个杂联芳基肽（CP1–CP5）的主链坐标分析，发现不同连接基团（BiAa、BiAb、BiAc）占据分立簇，而序列和溶剂变化仅次要影响。例如，CP1和CP2（不同序列和溶剂）的PCA分布重叠，但局部氢键网络不同（如CP1的转角多样性更大）。CP3和CP4（仅甲基取代）保持主要主链拓扑，但改变次要状态群体。此外，先前假设的稳定内环胺氢键在CP3–CP5中为瞬态（群体41–69%），表明高度动态的氢键网络。

**Resolving Fast and Slow Conformational Dynamics in CP7**
CP7显示慢速交换（87:13的群体比例）。对主要和次要峰集应用NMR/DFT工作流：主要峰集为两构象体快速交换集合（55%和32%），次要峰集为单构象体。主要构象体与ROE/MD模型RMSD低，但需第二构象体拟合全部数据。元动力学模拟偏置3Gly二面角，得到自由能景观，三个能量最小值与NMR/DFT构象体一致，且快速交换构象体间的能垒显著低于隔离慢速交换构象体的能垒，与实验观察一致。

**总结与结论**
研究人员开发了一种综合NMR/DFT方法，整合各向同性和各向异性NMR可观测参数与增强采样和DFT优化，成功解析了含芳基和杂联芳基的宏环肽的动态构象景观。该方法克服了传统NOE/MD单结构模型的局限性，揭示了宏环由最多三个相互转换的DFT级构象体组成，并识别主链连接基团为全局构象决定因素，而氢键网络具有高度动态性和结构特异性。研究还发现了芳基连接引起的快速脯氨酸顺反异构和慢速/快速交换共存的动力学层次。这一框架为宏环的精确构象分析提供了通用策略，指导合成修饰以稳定先前被忽视的构象状态，从而优化药理性质。结论部分翻译：准确表征宏环肽在溶液中的构象对于基于结构的药物设计及理解其物理化学性质至关重要。然而，含杂环肽的结构描述长期依赖源自传统NMR约束和力场模拟的静态模型，这些方法常无法捕捉构象异质性，将高度动态系统压缩为人为的时间平均结构。本研究通过整合互补的各向同性和各向异性NMR可观测参数与增强构象采样和DFT优化，超越了传统范式，解析了先前无法访问的构象状态，并给出了与实验可观测参数高度一致的集合描述。将该框架应用于8个芳基和杂联芳基连接的环肽，揭示这些宏环在DFT水平上最好描述为包含最多三个相互转换构象体的动态集合。通过考虑一个肽系列，研究人员识别出主链连接基序为全局肽形状的共同决定因素，而内部氢键模式对每个环肽基本独特。重要的是，集合描述还捕获了芳基连接肽中快速相互转换的顺反脯氨酸异构化，揭示了与经典肽相比意外的构象动力学模式。对于一个环肽，研究人员鉴定了NMR时间尺度上慢速和快速交换构象体的共存，这种动力学层次与元动力学模拟获得的自由能景观一致。宏环领域近期的概念进展强调了未被充分认识的构象相互转换的重要性，包括同形开关。在此背景下，本研究结果尤为重要，因为此类过程的表征严重依赖NMR衍生的结构分配。基于这些例子，研究人员展示了仅依赖平均NOE衍生距离进行柔性宏环构象分析的局限性，尤其是在实验可获得的NOE接触很少时，这凸显了互补描述符（如RDC）的价值。通过提供这些描述符，该框架应能指导靶向合成修饰策略，通过稳定先前被忽视的构象状态来评估药理性质。