基于肽的放射性示踪剂的开发与评估：在临床前模型中靶向TIM-3

《Frontiers in Immunology》：Development and evaluation of a peptide-based radiotracer for targeting TIM-3 in preclinical models

　　

摘要
引言：T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3, TIM-3）在T细胞耗竭中发挥关键作用，目前已有多种相关抑制性抗体进入临床试验。然而，与治疗性抗体的开发相比，TIM-3的体内非侵入性可视化研究进展滞后。本研究旨在开发一种靶向TIM-3的正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（Positron Emission Tomography/Computed Tomography, PET/CT）成像示踪剂，并探索其可视化肿瘤病灶的能力。
方法：研究人员合成了一种半胱氨酸修饰的、NOTA偶联的肽类NOTA-P24，并用氟-18进行放射性标记。通过摄取、竞争和流出研究，在体内评估了其稳定性和特异性。此外，在荷瘤动物上进行了PET/CT成像和生物分布研究。
结果：[¹⁸F]AlF-NOTA-P24在体外和体内对表达TIM-3的细胞表现出高特异性和亲和力。荷瘤小鼠的生物分布研究显示，该示踪剂在肿瘤中摄取高，且全身清除快，从而获得高对比度图像，并使健康组织受到的辐射暴露可忽略不计。
结论：本研究开发了一种靶向TIM-3的肽类探针[¹⁸F]AlF-NOTA-P24，具有优异的特异性和亲和力。该方法在TIM-3的非侵入性评估中具有潜力。

**论文解读：基于肽的放射性示踪剂[¹⁸F]AlF-NOTA-P24的开发及其在临床前模型中靶向TIM-3的评估**

**研究背景与问题**
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）约占85%。尽管免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）如抗程序性细胞死亡蛋白1（Programmed Cell Death 1, PD-1）和抗PD-配体1（PD-Ligand 1, PD-L1）药物在晚期肺癌治疗中发挥重要作用，但仅部分患者获益，且治疗过程中常出现疾病进展。已有证据表明，T细胞耗竭是这些限制的主要原因之一。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3, TIM-3）作为一种关键免疫检查点，在免疫治疗耐药中上调，其高表达可能促进对抗PD-1或抗CTLA-4治疗的适应性耐药。因此，TIM-3阻断与其他免疫检查点抑制剂联合可能增强抗肿瘤免疫，多个抗TIM-3抗体的临床试验正在进行中。然而，目前缺乏非侵入性方法来识别最可能对TIM-3阻断疗法产生应答的患者。正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（Positron Emission Tomography/Computed Tomography, PET/CT）作为一种分子成像技术，可用于非侵入性评估TIM-3表达。现有TIM-3靶向示踪剂多为抗体（如⁶⁴Cu-NOTA-RMT3-23、¹²⁴I-C23、¹²⁵I-C23），分子量大、循环时间长，需要注射后数天才能成像；而肽类示踪剂⁶⁸Ga-DOTA-P26的亲和力较低（亲和常数KD=3.44×10^-5 M）。因此，急需开发一种高亲和力、快速清除的肽类PET示踪剂。

**研究内容与结论**
本研究基于前期发现的P24肽（亲和常数KD=9.50×10^-8 M），通过偶联大环螯合剂NOTA并标记氟-18，构建了[¹⁸F]AlF-NOTA-P24，并在临床前模型中系统评估了其作为TIM-3靶向PET示踪剂的潜力。结果显示，该示踪剂具有高亲和力（半抑制浓度IC₅₀=44.51 nM）、高放射化学纯度（>90%）、优良的体内外稳定性（在PBS和FBS中4小时保留率>90%）、快速的肾脏清除和较低的背景信号，能够在注射后短时间内实现高对比度的肿瘤成像。该研究首次报道了¹⁸F标记的TIM-3靶向肽类示踪剂，为TIM-3的非侵入性评估提供了新工具。论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下核心技术：
1. **生物信息学分析**：从TCGA数据库获取523例肺腺癌（Lung Adenocarcinoma, LUAD）患者的临床与分子数据，利用R软件进行生存分析和免疫浸润评估。
2. **分子对接**：使用PyRx软件（含Autodock Vina）对NOTA-P24与人TIM-3蛋白（PDB ID: 5F71）进行对接，预测结合模式。
3. **细胞模型构建**：通过慢病毒转染人非小细胞肺癌细胞（A549），构建高表达TIM-3的A549^TIM-3细胞系，并用免疫荧光和Western blot验证。
4. **放射性标记与稳定性测试**：采用[¹⁸F]AlF法标记NOTA-P24，通过radio-HPLC评估在PBS和胎牛血清（FBS）中的稳定性。
5. **体外特性评估**：包括竞争结合实验（测定IC₅₀）、细胞摄取实验、阻断实验（加入过量未标记前体）和内化实验。
6. **动物模型**：将A549或A549^TIM-3细胞接种于BALB/c裸鼠及裸鼠（nude rats）右肩，建立异种移植瘤模型。
7. **体内成像与生物分布**：进行PET/CT静态和动态成像，计算标准化摄取值最大值（SUV_max）；离体测量各组织放射性计数，以每克组织注射剂量百分比（%ID/g）表示。
8. **免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）**：验证肿瘤组织TIM-3表达。
9. **安全性评估**：通过血常规、血清生化及组织病理学检查评估急性与慢性毒性。

**研究结果**
**1. 生物信息学分析**
基于TCGA数据库分析，研究人员发现HAVCR2（TIM-3编码基因）高表达与LUAD患者风险评分升高和死亡率增加相关。HAVCR2表达与基质评分、免疫评分及总评分（估计评分）正相关，提示其与PD1阳性及CTLA-4/PD1双阳性患者免疫检查点阻断疗效相关。此外，HAVCR2表达与免疫抑制基因（如LAIR1、PDCD1LG2、CTLA-4、PDCD1）及抑制性免疫细胞（如M2巨噬细胞、中性粒细胞、活化CD4⁺记忆T细胞）浸润增加相关，表明HAVCR2在LUAD中可能发挥不利作用。

**2. 分子对接**
通过分子对接，NOTA-P24与人TIM-3蛋白结合，涉及残基Glu2、Thr20、Tyr56、Asn64、Asp66和Glu100，优化结合能为-8.2 kcal/mol，表明具有强结合力。

**3. 免疫荧光与Western blot**
免疫荧光和Western blot验证了A549^TIM-3细胞中TIM-3的显著高表达。IVIS成像显示FITC-Acp-P24在A549^TIM-3荷瘤小鼠肿瘤中产生绿色荧光信号，IHC染色进一步证实了肿瘤模型成功建立。

**4. 放射化学**
[¹⁸F]AlF-NOTA-P24的合成在40分钟内完成，在含乙腈条件下非衰变校正的放射化学产率为30.5±8.3%（n=10），放射化学纯度>90%，摩尔活性约为29.8 MBq/nmol。在PBS和FBS中孵育1、2、4小时后，完整示踪剂比例>90%，表明稳定性良好。

**5. [¹⁸F]AlF-NOTA-P24的体外特性**
竞争实验显示，该示踪剂对表达人TIM-3的细胞具有特异性结合，IC₅₀为44.51 nM，与P24肽的亲和力（95 nM）相当。细胞摄取实验中，A549^TIM-3细胞的放射性计数显著高于A549对照细胞（30分钟时：1605.00±281.60 vs 1190.00±179.26 CPM/10⁶细胞，P=0.03）。阻断实验显示，加入过量未标记前体后，A549^TIM-3细胞的放射性显著降低（30分钟时：1025.00±281.60 vs 118±20.78 CPM/10⁶细胞，P=0.007），证实了特异性。内化实验表明，30分钟后约38.87%的结合放射性位于细胞内，4小时后仍有41.48%被内化。

**6. 生物分布**
在A549^TIM-3荷瘤小鼠中，[¹⁸F]AlF-NOTA-P24主要经肾脏排泄（30分钟时肾摄取7.59±2.29%ID/g），脾脏也有较高摄取（60分钟时2.46±1.41%ID/g）。肿瘤摄取在30分钟时达到峰值（3.76±0.87%ID/g），肿瘤与肌肉比值在0.5、1、2小时分别为7.5、9.2和9.6。大部分正常器官（如脑、心、肺、胰腺、肌肉）在4小时后放射性低于检测限，表明背景低。

**7. PET/CT成像**
静态PET/CT成像显示，A549^TIM-3肿瘤的[¹⁸F]AlF-NOTA-P24摄取显著高于A549肿瘤，且预注射未标记前体后肿瘤摄取显著降低（阻断组肿瘤与肌肉比值为2.6，未阻断组为10.3，60分钟），证实了示踪剂的特异性。动态PET/CT成像（裸鼠）显示，肾脏为主要清除途径，肿瘤与背景对比度高，注射后45分钟即可获得优异图像。脾脏因免疫细胞富集而呈现高信号，与生物分布结果一致。

**8. 毒性评估**
注射[¹⁸F]AlF-NOTA-P24后，小鼠未见不良事件，白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞计数均在正常范围，血清生化指标未显示肾或肝损伤，心、肝、脾、肺、肾的H&E染色未见解剖异常，表明该示踪剂具有良好的安全性。

**讨论与结论**
讨论部分指出，[¹⁸F]AlF-NOTA-P24是首个经¹⁸F标记的TIM-3靶向肽类示踪剂，相比抗体类示踪剂具有分子量小、肿瘤穿透力强、肾脏清除快、化学合成简便、成本低等优势。其与NOTA偶联后亲和力未降低，且优于已有肽类示踪剂⁶⁸Ga-DOTA-P26。示踪剂的肾清除模式降低了肝胆和胃肠道背景干扰，但脾脏和肾脏的生理性高摄取需在腹部病变成像时注意。此外，示踪剂在主要器官中未引起明显毒性，支持其进一步临床转化。研究局限性包括：线性肽的体内稳定性可能低于环肽，未来可通过引入非天然氨基酸、末端封端和聚乙二醇化（PEGylation）策略改善；当前研究主要针对肺癌，其他肿瘤类型适用性未知；因PET/CT仪器分辨率限制，动态成像在裸鼠而非小鼠进行；化合物亲水性有待提高；由于机构资质限制，尚未进行临床患者实验。

**研究结论**
基于先导肽，研究人员开发了[¹⁸F]AlF-NOTA-P24，用于通过PET/CT定量肿瘤微环境中的TIM-3表达。研究结果证明了[¹⁸F]AlF-NOTA-P24的优越特性，包括高亲和力、满意的放射化学纯度、出色的稳定性、显著的肿瘤摄取以及注射后短时间内良好的肿瘤与背景比值。这些发现共同强调了该示踪剂在非侵入性评估TIM-3表达和T细胞耗竭状态方面的潜力。