《Frontiers in Immunology》：Effects of immunosuppression on tracheal mucosal responses after infection with Mycoplasma gallisepticum in vaccinated and unvaccinated chickens
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摘要：引言：疫苗接种是控制鸡感染鸡毒支原体（M. gallisepticum）最常用的方法。然而，并发免疫抑制可能会损害疫苗效力。方法：本研究调查了由鸡贫血病毒（CAV）或传染性法氏囊病病毒（IBDV）诱导的免疫抑制（在接种M. gallisepticum活疫
摘要：引言：疫苗接种是控制鸡感染鸡毒支原体（M. gallisepticum）最常用的方法。然而，并发免疫抑制可能会损害疫苗效力。方法：本研究调查了由鸡贫血病毒（CAV）或传染性法氏囊病病毒（IBDV）诱导的免疫抑制（在接种M. gallisepticum活疫苗株ts-304（Vaxsafe MG304）之前或之后给药）对气管宿主对后续强毒M. gallisepticum攻毒反应的影响。研究人员通过全基因组转录谱分析评估这些组的气管反应，并将其与未暴露于CAV或IBDV的未接种-未攻毒组、未接种-攻毒组、接种-未攻毒组和接种-攻毒组进行比较。结果：与免疫正常组相比，免疫抑制导致气管转录反应显著差异，无论CAV或IBDV感染的时间如何。IBDV感染组的转录差异比CAV感染组更显著。对差异转录基因的功能分析揭示了M. gallisepticum对免疫抑制组气管黏膜的细胞外和细胞内信号传导、细胞通讯、细胞肌动蛋白动力学、细胞骨架形成和细胞代谢通路的不利影响。此外，有迹象表明免疫抑制组的先天性和适应性免疫反应均下调，包括细胞因子信号传导、抗原加工呈递和免疫细胞受体信号传导。具体而言，研究结果表明，CAV感染损害了气管黏膜中的促炎性和适应性T细胞反应。结论：研究结果表明，接种后诱导的初级免疫反应和强毒M. gallisepticum攻毒后诱导的次级免疫反应均受到这两种病毒感染的影响。结合先前在CAV和IBDV感染组中观察到的抗M. gallisepticum抗体滴度降低以及强毒M. gallisepticum回收率增加，本研究中检测到的显著转录变化突出了细胞介导免疫（CMI）和体液免疫（HI）在疫苗诱导保护中的作用，因为CAV主要影响CMI，而IBDV主要影响HI。这些发现将有助于确定免疫抑制动物中活减毒支原体疫苗效力降低的机制。
论文解读文章
**研究背景与问题**
鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）是家禽中一种全球性的重要细菌病原体，可引起鸡慢性呼吸道疾病、火鸡传染性窦炎及家朱雀结膜炎，导致饲料消耗减少、体重增重降低、产蛋率和孵化率下降及屠体废弃率增加，造成严重经济损失。疫苗接种是控制该病最常用的方法，但鸡群中常并发鸡贫血病毒（CAV）或传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染引起的免疫抑制，这可能损害疫苗效力。既往研究已表明，免疫抑制可加重M. gallisepticum感染后的病理损伤和细菌载量，并降低活减毒疫苗ts-304（Vaxsafe MG304）的效力。然而，CAV或IBDV感染引起的免疫抑制对M. gallisepticum靶器官（如气管）全基因组转录变化的影响尚未被研究。因此，本研究旨在通过全基因组转录分析，探讨免疫抑制对接种疫苗后鸡气管黏膜宿主反应的影响，以阐明疫苗效力降低的分子机制。
**研究内容与结论**
研究人员开展了一项系统性实验，使用80只白来航特异性无病原体（SPF）鸡，随机分为8组：阴性对照组、仅接种组、仅攻毒组、接种+攻毒组、CAV-接种-攻毒组、接种-CAV-攻毒组、IBDV-接种-攻毒组、接种-IBDV-攻毒组。通过比较各组气管黏膜的全基因组转录谱，发现免疫抑制组（CAV或IBDV感染）与免疫正常组在转录水平上存在显著差异，且IBDV感染组的转录变化更为广泛。功能分析表明，免疫抑制导致M. gallisepticum对气管黏膜的细胞外与细胞内信号传导、细胞通讯、肌动蛋白动力学、细胞骨架形成及代谢通路产生不利影响，同时下调先天性和适应性免疫反应（包括细胞因子信号、抗原加工呈递和免疫细胞受体信号）。具体而言，CAV感染主要损害促炎性和适应性T细胞反应，而IBDV感染则更严重地影响体液免疫。结论指出，接种后诱导的初级免疫反应和攻毒后诱导的次级免疫反应均受两种病毒感染影响，结合先前观察到的抗体滴度降低和细菌回收率增加，强调细胞介导免疫（CMI）和体液免疫（HI）在疫苗保护中的协同作用。该研究首次揭示了免疫抑制鸡中M. gallisepticum疫苗效力降低的转录组基础，发表在《Frontiers in Immunology》。
**关键技术方法**
本研究采用以下关键技术方法：实验动物为80只白来航SPF鸡，随机分为8组（每组10只），分别进行CAV（104 TCID50，滴眼）或IBDV（103 TCID50，滴眼）感染，随后在3周龄时用M. gallisepticum活疫苗株ts-304（106.0 CCU，滴眼）接种，5周后用强毒株Ap3AS（106.5 CCU/ml，气溶胶）攻毒，2周后安乐死。气管黏膜组织总RNA提取后，使用Illumina NextSeq500平台进行150 bp双端测序，获得RNA-seq数据。通过bowtie2和RSEM将reads比对至鸡参考基因组（Ensembl release 101），利用limma、edgeR和Glimma进行差异转录基因（DEG）分析（阈值：log2倍数变化≥1，FDR<0.05）。功能注释采用topGO进行基因本体（GO）富集分析，PANTHER分类工具进行Reactome通路和蛋白类别富集分析（FDR<0.05或0.01）。样本队列来源明确为80只SPF鸡，分组设计及感染/接种时间点已详细说明。
**研究结果**
1. **The challenged-only group and the immunosuppressed groups had significant differences in transcription compared to other groups**
通过RNA-seq测序，鉴定出16,779个蛋白编码基因，其中13,576个基因用于差异分析。仅攻毒组与阴性对照组、仅接种组和接种+攻毒组相比，分别有1,715、1,794和701个差异转录基因（DEG）。四个免疫抑制组（CAV-接种-攻毒、接种-CAV-攻毒、IBDV-接种-攻毒、接种-IBDV-攻毒）与阴性对照组、仅接种组和仅攻毒组相比，DEG数量显著增加（CAV组约1,861-2,949个，IBDV组约2,243-5,746个）。IBDV感染组的DEG数量多于CAV感染组，且所有比较中下调基因多于上调基因。
2. **There were three distinct clusters of groups based on their transcriptional profiles**
基于平均log2 CPM值的无监督聚类显示三个明显簇：阴性对照组、仅接种组和接种+攻毒组聚为一簇；四个免疫抑制组聚为一簇；仅攻毒组单独为一簇。这表明免疫抑制显著改变了气管黏膜对疫苗接种和后续攻毒的转录响应，与免疫正常组截然不同。
3. **Gene ontologies related to RNA and protein metabolism, and cellular respiration, were significantly enriched with genes up-regulated in comparisons of the immunosuppressed groups with the negative-control and vaccinated-only groups**
在免疫抑制组与阴性对照组或仅接种组比较中，上调基因富集的GO术语包括核糖核蛋白复合物、细胞质、呼吸链等细胞组分；rRNA结合、核糖体结构成分、氧化还原酶活性等分子功能；核糖体生物合成、代谢过程、细胞酰胺代谢等生物过程。Reactome通路分析显示这些上调基因富集于RNA代谢、蛋白质代谢、柠檬酸循环、线粒体生物合成和DNA修复通路。
4. **Gene ontologies related to organisation of chromatin, cell junction and cellular cytoskeleton, cell migration, cell cycle and cellular signalling were significantly enriched with genes down-regulated in the immunosuppressed groups compared with the negative-control and vaccinated-only groups**
下调基因富集的GO术语涉及锚定连接、细胞外基质、染色体、细胞骨架等细胞组分；分子结合、磷酸转移酶活性、细胞骨架运动活性等分子功能；染色体组织、细胞连接组织、细胞骨架组织、细胞迁移、细胞周期、GTP酶活性调节、细胞信号传导等生物过程。Reactome通路显示下调基因富集于转录、细胞外信号传导、细胞外基质组织、细胞内信号、翻译后修饰、凋亡、翻译和免疫反应等通路。
5. **Gene ontologies related to cilium and cytoskeleton organisation, and receptor binding, were enriched with genes up-regulated genes in the immunosuppressed groups compared with the challenged-only group**
与仅攻毒组相比，免疫抑制组上调基因富集的GO术语包括纤毛、细胞骨架、细胞呼吸链等细胞组分；趋化因子受体结合、蛋白结合、过氧化物酶活性等分子功能；纤毛组织/组装、微管基础过程、抗菌分解代谢、细菌防御反应等生物过程。
6. **Gene ontologies related to DNA replication, cell proliferation and migration, and immune response were enriched with genes down-regulated in the four immunosuppressed groups compared with the challenged-only group**
与仅攻毒组相比，免疫抑制组下调基因富集的GO术语涉及核糖核蛋白复合物、核染色体、纺锤体、片状伪足、囊泡等细胞组分；蛋白、核酸、组蛋白、染色质、离子结合及解旋酶活性；DNA代谢、免疫反应调节、淋巴细胞活化、白细胞迁移、防御反应、细胞死亡、凋亡等生物过程。Reactome通路显示下调基因富集于DNA复制和细胞周期、免疫反应（包括细胞因子/趋化因子信号、MHC I类抗原加工呈递、TCR信号）、细胞信号传导、蛋白质代谢、止血和膜运输等通路。
7. **Protein classes involved in RNA and protein metabolism and oxidative stress were enriched with up-regulated genes in the immunosuppressed groups compared with negative-control and vaccinated-only groups**
蛋白类别分析显示，与阴性对照组或仅接种组相比，免疫抑制组上调基因富集的蛋白类别主要参与RNA和蛋白质代谢、氧化应激。
8. **Protein classes involved in immune responses, cell signalling, cell proliferation, organisation of cytoskeleton and extracellular matrix were enriched with genes down-regulated in the immunosuppressed groups compared with negative-control and vaccinated-only groups**
下调基因富集的蛋白类别涉及免疫反应、细胞信号传导、细胞增殖分化与迁移、细胞外基质、细胞骨架、转录和翻译等。
9. **Protein classes involved in nucleic acid metabolism, cell signalling, protein metabolism, organisation of cytoskeleton, and immune responses were enriched with genes down-regulated in the immunosuppressed groups compared with the challenged-only group**
与仅攻毒组相比，免疫抑制组下调基因富集的蛋白类别参与核酸代谢、细胞信号传导、蛋白质代谢、细胞骨架组织和免疫反应。
**讨论与结论**
本研究发现，无论CAV或IBDV感染在疫苗接种前还是后发生，免疫抑制均导致气管黏膜对M. gallisepticum攻毒的转录反应发生显著改变。免疫抑制组与免疫正常组（包括仅攻毒组）在转录谱上明显分离，表明疫苗诱导的保护作用被干扰。功能分析揭示，免疫抑制组中先天性和适应性免疫反应（包括细胞因子信号、抗原加工呈递和免疫细胞受体信号）普遍下调，且CAV感染主要抑制T细胞介导的促炎性和适应性反应，而IBDV感染不仅影响T细胞通路，还导致纤毛功能和细胞连接组织下调，提示黏膜完整性受损。结合先前观察到的血清抗体滴度降低和细菌回收率增加，本研究强调了细胞介导免疫（CMI）和体液免疫（HI）在疫苗保护中的协同作用，其中CAV主要影响CMI，IBDV主要影响HI。
**研究结论**：这是首次在接种疫苗并随后受家禽病原体攻毒的免疫抑制鸡中研究全基因组转录变化。研究结果表明，CAV或IBDV感染引起的免疫抑制改变了鸡气管黏膜的宿主反应（包括免疫反应），凸显了免疫抑制鸡中M. gallisepticum疫苗效力降低所涉及的基因和通路。
