B细胞非霍奇金淋巴瘤中肿瘤免疫微环境谱系分析可将患者分层为不同预后组

《Frontiers in Immunology》：Tumoral immune microenvironment profiling in B-cell non-Hodgkin lymphoma stratifies patients in different prognostic groups

　　

摘要

背景：非霍奇金淋巴瘤（NHL）是一组具有异质性的来源于B细胞的恶性肿瘤。既往研究表明，肿瘤免疫微环境（TIM）成分与肿瘤发生及进展相关。此外，近期转录组学分析显示，TIM状态可将患者分层为不同的预后组；然而，这些认识尚未在临床中得到应用。

方法：研究人员采用多参数流式细胞术对64份NHL活检样本和16份反应性淋巴组织（rLT）对照的TIM进行了表征，检测内容包括主要细胞亚群、T细胞亚群以及健康/恶性B细胞和T细胞上的免疫检查点表达。随后根据TIM谱对个体进行分层，并评估其预后价值。同时，研究人员还采用靶向DNA测序评估了突变图谱。

结果：流式细胞术分析显示，部分患者存在人类白细胞抗原I类（HLA-I）下调，并且抑制性配体表达增加，这一现象在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中尤为明显。与rLT相比，T细胞表现出向效应型谱系偏移，并伴有更高的耗竭标志物表达。具有特定突变的患者之间，TIM组成并无显著差异。基于TIM的聚类鉴定出3个不同分组，其主要区分特征为T细胞耗竭。研究人员在本队列中最常见的诊断类型——滤泡性淋巴瘤（FL）中评估了TIM分类的预后影响。位于C1簇的FL患者以CD4⁺ T细胞和初始T细胞频率较高为特征，与C2簇FL病例相比，具有更长的治疗启动时间、总生存期和无进展生存期。

结论：基于流式细胞术对NHL患者TIM谱进行分类能够预测FL患者结局，提示其在风险分层以及识别NHL潜在免疫治疗靶点方面具有价值。

该研究发表于《Frontiers in Immunology》，聚焦B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）中肿瘤免疫微环境（TIM）的临床分层价值。NHL是一组生物学异质性极强的淋巴系统肿瘤，其中多数起源于B细胞克隆性扩增。尽管弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和滤泡性淋巴瘤（FL）等主要亚型在一线治疗后已有相当比例患者获得缓解，但仍有部分患者发生复发、难治或早期进展。近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和双特异性抗体等免疫治疗手段改善了部分患者预后，也提示宿主免疫状态，尤其是肿瘤局部免疫生态，对疾病演进和治疗反应具有重要影响。

既往研究已证明，TIM不仅参与淋巴瘤发生发展，还可能决定患者预后。例如，肿瘤细胞可通过下调HLA-I、改变CD58表达或上调PD-L1、CD112、CD155等免疫检查点相关配体，削弱T细胞介导的抗肿瘤应答；而持续抗原刺激又会诱导T细胞耗竭，使PD-1、TIGIT、TIM3、LAG-3、CD244和CD160等抑制性受体持续高表达。与此同时，转录组学研究已经能够依据TIM状态对淋巴瘤患者进行预后分层，但这些方法多依赖甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本和复杂分析流程，尚未转化为常规临床工具。因此，开展一项基于新鲜肿瘤活检、可直接反映细胞表型与B/T细胞互作状态的研究，具有明确的现实意义。

为此，研究人员纳入80例个体样本，其中包括64例NHL肿瘤活检和16例反应性、非恶性淋巴组织（rLT）作为对照，系统描绘NHL的TIM特征，并评估其预后相关性。研究对象涵盖32例FL、17例DLBCL、7例边缘区淋巴瘤（MZL）、5例套细胞淋巴瘤（MCL）、2例Burkitt淋巴瘤（BL）和1例高级别B细胞淋巴瘤（HGBCL）。此外，研究人员还对其中60例患者进行了靶向DNA测序，以从遗传层面探讨突变图谱与TIM之间的关系。

主要技术方法方面，研究人员首先对新鲜淋巴组织活检进行机械解离，应用多参数流式细胞术检测主要淋巴细胞亚群、T细胞分化状态、Treg样细胞、辅助性T细胞亚群，以及恶性/健康B细胞和T细胞上的抑制性与共刺激性分子表达；其次，对FFPE活检样本提取DNA，采用覆盖190个血液肿瘤常见突变基因编码区的靶向二代测序（NGS）面板进行突变检测；再次，使用k-means无监督聚类与主成分分析（PCA）整合54项免疫表型参数实现TIM分群；最后，结合Kaplan-Meier、生存曲线比较及Cox比例风险模型评估其临床预后价值。

在结果部分，论文首先报告了患者特征与分子背景。FL中最常见突变基因为CREBBP、KMT2D和TNFRSF14，DLBCL中则以KMT2D和CREBBP较常见，MZL呈现更高遗传异质性。FL中多数病例可见BCL2重排（BCL2-R）。这一结果与既往文献基本一致，说明该队列在分子层面具有代表性。

在“Lymphoma cells express checkpoint ligands more frequently than healthy B cells from rLT”这一部分，研究人员发现，各类淋巴瘤样本中B细胞均为主要淋巴细胞群，且相较rLT，所有淋巴瘤亚型均表现出CD4⁺ T细胞比例下降，CD4/CD8比值倒置，在DLBCL中尤为突出。对肿瘤细胞免疫表型进一步分析显示，HLA-I表达存在明显异质性，部分病例出现HLA-I高表达细胞减少或HLA-I阴性细胞增多。与此同时，DLBCL中PD-L1和CD155表达增加，FL与DLBCL中CD112表达升高；ICOS-L在FL和DLBCL中更常见，41BB-L则主要在DLBCL中上调，而OX40-L无显著差异。尽管文献提示CD58突变可能介导DLBCL免疫逃逸，但本队列未检出CD58突变，且CD58表达并未下降。该部分结果说明，与反应性淋巴组织中的健康B细胞相比，淋巴瘤细胞更常表达免疫检查点相关配体，提示其具备更明显的免疫抑制和免疫逃逸特征。

在“T cells within NHL tumors are mostly effector cells with increased expression of exhaustion markers”部分，研究人员显示NHL肿瘤内T细胞整体向效应型分化偏移。FL和DLBCL患者的CD8⁺与CD4⁺初始T细胞（TN）比例下降，CD4⁺中央记忆T细胞（TCM）也减少，而效应记忆T细胞（TEM）占优势，提示肿瘤微环境中存在抗原经历性T细胞扩增。在排除TN后对记忆T细胞（Tmem）进行分析发现，FL中CD8⁺和CD4⁺ Tmem的PD-1、TIGIT和LAG-3表达升高，CD4⁺ Tmem还表现出更高TIM3表达；DLBCL中CD8⁺和CD4⁺ Tmem的PD-1、TIGIT、LAG-3和TIM3均更高，DLBCL的CD4⁺ Tmem还伴有CD244升高。PD-1与TIGIT共表达在NHL中更常见，且PD-1^high Tmem频率增加，主要出现在效应型细胞群中，提示更深度的T细胞耗竭。此外，41BB在FL和DLBCL的CD4⁺/CD8⁺ Tmem中均上调，ICOS在FL的CD8⁺ Tmem中升高，OX40在FL和DLBCL的CD4⁺ Tmem中升高。研究还发现，Treg样细胞在FL和DLBCL中增多，而Th1、Th2和Th17比例无显著变化。这些结果表明，NHL肿瘤内T细胞虽具有抗原驱动的活化/效应化特征，但同时伴随显著耗竭和免疫抑制状态。

在“TIM-based clustering stratifies lymphoma patients in three groups based on T-cell exhaustion”部分，研究人员基于54项流式免疫表型参数实施k-means无监督聚类，识别出3个TIM分群。三类分群的首要区分因素是T细胞耗竭，其中主成分第一维度（Dim1）主要由Tmem中的PD-1和TIGIT表达驱动；第二维度（Dim2）则由B细胞上的CD155、CD112、PD-L1表达，以及CD4⁺ TEMRA、PD-1⁺和CD244⁺ CD4⁺ Tmem水平共同定义。C1富集rLT样本，呈现CD4⁺ T细胞较多、PD-1阴性比例较高以及TCM/TN比例升高的“反应性”特征；多数FL聚集于C2，表现为Tmem中PD-1、TIGIT、ICOS和LAG-3较高；多数DLBCL进入C3，该簇以肿瘤细胞抑制性配体表达更高和TIM3⁺ Tmem增多为特征。进一步分析表明，各分群与特定基因突变之间未见显著富集关系，提示遗传改变可能影响TIM，但并不能完全决定其构成。

在“TIM-based clustering stratifies FL patients in two different prognostic groups”部分，研究人员聚焦样本数最多的FL进行临床相关性评估。位于C1的FL病例仅7例，而C2中有25例。C1富集“观察等待”（watch-and-wait, W&W）管理策略病例及BCL2-R阴性病例，并且FLIPI评分以低危患者为主；C2则更常见高危FLIPI评分与较高肿瘤负荷。生存分析显示，C1患者治疗启动时间（TTT）更长；总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）也优于C2，尽管部分指标未达到显著性水平。多变量分析进一步提示，TIM分群的预后影响会受到FLIPI评分和肿瘤负荷的影响，这说明TIM状态可为现有风险模型提供额外免疫学信息。

讨论部分指出，本研究从遗传和免疫表型两个层面系统刻画了NHL的TIM，证实不同NHL亚型均存在不同程度的肿瘤免疫抑制特征，尤其是DLBCL中更明显的抑制性配体表达和T细胞耗竭。研究还强调，既往基于RNA测序的TIM分型虽具有预后价值，但临床推广受限；相比之下，基于新鲜活检和多参数流式细胞术的策略更贴近临床应用场景。该研究的局限性在于新鲜样本获取困难、NHL生物学异质性高导致各亚型样本量有限，以及流式细胞术无法反映肿瘤微环境的空间结构与免疫突触组织方式。因此，未来仍需结合空间组学与转录组学手段进行互补验证。

研究结论可译为：对NHL患者新鲜肿瘤活检进行基于流式细胞术的TIM谱分类能够预测FL患者的结局，凸显其在风险分层中的价值，并有助于识别NHL中潜在的免疫治疗靶点。总体而言，该研究表明，TIM免疫分型不仅揭示了B细胞淋巴瘤中肿瘤细胞与T细胞互作的关键失衡机制，也为将免疫微环境纳入临床预后评估和治疗决策提供了直接证据。