小腹膜巨噬细胞和树突状细胞在伴随免疫模型中与生存期延长相关的积累

《Frontiers in Immunology》：Accumulation of small peritoneal macrophages and dendritic cells in a concomitant immunity model associated with prolonged survival

　　

目的：本研究利用DBA/2-SL2小鼠伴随肿瘤免疫模型，探讨了腹膜巨噬细胞对肿瘤控制的贡献。
方法：研究人员将雌性DBA/2小鼠置于伴随肿瘤模型中，通过皮下（SC）注射SL2淋巴瘤细胞建立原发性肿瘤，随后进行腹腔内（IP）SL2攻击以诱导继发性肿瘤。在IP攻击后4天，通过流式细胞术分析腹膜免疫细胞。根据总活细胞回收量计算绝对细胞数。为了评估功能性抗肿瘤活性，研究人员通过磁分离分离出CD11b⁺F4/80⁺腹膜巨噬细胞，并将其与SL2细胞一起过继转移至初始小鼠。在额外实验中，小鼠接受了重复的SL2细胞IP注射。数据分析采用非参数统计检验。
结果：继发性IP SL2肿瘤小鼠的生存期延长与腹膜免疫组成的显著改变相关。流式细胞术分析显示，在继发性IP肿瘤小鼠中，小腹膜巨噬细胞（SPMs）和树突状细胞（DCs）显著积累。继发性IP肿瘤组中SPMs（CD11b^intF4/80^int）和DCs（CD11c⁺）的绝对计数显著增加，且这些群体之间存在正相关但不具有统计学显著性。相比之下，原发性IP肿瘤小鼠表现为CD11c^-CD11b^-F4/80^-细胞（可能包括SL2肿瘤细胞）的扩增、B淋巴细胞（CD19⁺）和大腹膜巨噬细胞（LPMs）（CD11b^hiF4/80^hi）数量减少，以及CD11b^lowF4/80^int细胞数量增加。来自继发性IP肿瘤小鼠的腹膜巨噬细胞的过继转移并未延长生存期。与仅SC肿瘤组中5只小鼠中的1只相比，重复IP给予SL2细胞与SC荷瘤小鼠中5只中的3只生存改善相关，尽管该差异未达到统计学显著性。
结论：伴有继发性IP SL2肿瘤的DBA/2小鼠的生存期延长与独特的腹膜免疫格局相关，其特点是SPMs和DCs的积累。虽然单独巨噬细胞不足以控制肿瘤生长，但重复IP肿瘤攻击提示了全身性抗肿瘤活性的趋势。总之，这些发现强调了SPMs和DCs是与该模型中生存获益相关的突出细胞。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在肿瘤生物学中具有双重作用，既可能抑制也可能促进恶性肿瘤进展。然而，M1/M2极化模型可能过于简化，不同肿瘤区域巨噬细胞标志物表达的异质性表明存在多种TAM亚群。在DBA/2-SL2同源伴随免疫系统中，皮下（SC）注射的SL2肿瘤细胞可致死小鼠，但初次肿瘤注射数天后再次接种的SL2细胞不会形成肿瘤，提示二次攻击位点存在杀伤机制。既往研究显示，初次和二次肿瘤植入物均含有40-50%的巨噬细胞，且体外对SL2细胞具有细胞毒性。本研究旨在利用该模型，探究腹膜巨噬细胞在SL2肿瘤控制中的作用，重点关注小腹膜巨噬细胞（SPMs）和大腹膜巨噬细胞（LPMs）以及树突状细胞（DCs）在二次IP肿瘤攻击中的动态变化。

**研究内容与结论**
研究人员采用DBA/2小鼠，通过SC注射SL2细胞建立原发性肿瘤，10天后进行IP注射诱导继发性肿瘤，比较继发性IP肿瘤组、原发性IP肿瘤组和仅SC肿瘤组的生存期及腹膜免疫细胞组成。结果显示，继发性IP肿瘤组小鼠生存期显著长于原发性IP肿瘤组，且未出现腹水。流式细胞术分析表明，继发性IP肿瘤组中SPMs（CD11b^intF4/80^int）和DCs（CD11c⁺）的绝对计数和比例显著增加，而原发性IP肿瘤组则表现为CD11c^-CD11b^-F4/80^-细胞（可能为SL2肿瘤细胞）扩增、B淋巴细胞和LPMs减少。SPMs与DCs绝对计数呈正相关（Spearman r=0.80，p=0.13）。过继转移实验显示，从继发性IP肿瘤小鼠分离的腹膜巨噬细胞与SL2细胞共转移至初始小鼠后，未能延长生存期。重复IP注射SL2细胞（共3次）后，仅SC肿瘤组5只小鼠中1只存活，而重复IP注射组5只中3只存活，但差异无统计学显著性（log-rank检验p=0.2875）。这些结果提示，继发性IP肿瘤攻击驱动了单核细胞来源的SPMs和DCs的积累，但单独巨噬细胞不足以控制肿瘤生长，重复刺激可能诱导系统性抗肿瘤活性趋势。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

**关键技术方法**
本研究主要采用以下关键方法：1）DBA/2小鼠SL2淋巴瘤伴随肿瘤模型，样本来源为立陶宛国立创新医学研究所动物设施饲养的雌性DBA/2小鼠（8-10周龄）；2）流式细胞术分析腹膜免疫细胞亚群，根据Bou Ghosn等人（2010）的策略进行门控，识别LPMs（CD11b^hiF4/80^hi）、SPMs（CD11b^intF4/80^int）、DCs（CD11c⁺）、B淋巴细胞（CD19⁺）及其他细胞；3）磁分离（MACS）技术从继发性IP肿瘤小鼠腹膜细胞中分离CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞，并进行过继转移实验；4）重复IP注射SL2细胞以评估系统性抗肿瘤效应；5）非参数统计检验（Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验、Spearman秩相关、Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验）。

**研究结果**
**3.1 继发性IP肿瘤小鼠生存期延长**
与原发性IP肿瘤组（中位生存17天）相比，继发性IP肿瘤组（SC+IP）生存期显著延长（log-rank检验p<0.05），且未出现腹水。仅SC肿瘤组中1/3小鼠存活超过70天。该结果表明，原发性SC SL2肿瘤的存在与继发性IP肿瘤生存改善相关。

**3.2 继发性IP肿瘤攻击驱动SPMs和DCs扩增**
流式细胞术分析显示，继发性IP肿瘤组中髓系细胞（CD11b^hiF4/80^hi、CD11b^intF4/80^int、CD11c⁺、CD11b^lowF4/80^int）比例高于原发性IP肿瘤组；原发性IP肿瘤组中CD11b^-F4/80^-细胞比例显著升高（p<0.05），B淋巴细胞比例降低（p<0.01）。绝对计数方面，继发性IP肿瘤组SPMs和DCs显著增加，而原发性IP肿瘤组中CD11c^-CD11b^-F4/80^-细胞、B淋巴细胞和LPMs的绝对计数变化与比例一致。SPMs与DCs绝对计数呈正相关（Spearman r=0.80，p=0.13）。

**3.3 单核细胞来源的先天性细胞的体内抗肿瘤效应评估**
过继转移实验：将继发性IP肿瘤小鼠的腹膜巨噬细胞（含SPMs和LPMs）与SL2细胞以1:1比例共转移至初始小鼠，所有受体小鼠均于21天内死亡，与仅接受SL2细胞的对照组（28天死亡）无显著差异，且均出现腹水。重复IP注射实验：仅SC肿瘤组5只中1只存活，重复IP注射组5只中3只存活（log-rank检验p=0.2875），差异未达统计学显著性，但显示系统性抗肿瘤活性的趋势。

**讨论与结论**
讨论部分指出，继发性IP肿瘤小鼠的生存期延长与SPMs和DCs的显著积累相关，这与既往在原发性肿瘤模型中观察到的SPMs促进肿瘤进展的报道不同，提示SPMs的功能可能随肿瘤发展阶段和免疫环境（如预先存在的系统性免疫条件）而改变。研究人员认为，二次肿瘤攻击可能优先促进单核细胞募集和局部分化，且SPMs与DCs的平行积累符合训练免疫（trained immunity）的特征，即单核细胞来源的巨噬细胞和DCs通过表观遗传和代谢重编程获得记忆样特性。然而，过继转移实验表明单独巨噬细胞不足以控制肿瘤生长，且1:1的效应细胞与靶细胞比例可能过低，未来需采用更高比例验证。此外，T淋巴细胞在伴随免疫中可能发挥关键作用，但流式细胞术显示继发性肿瘤组中CD11c^-CD11b^-F4/80^-细胞比例与初始小鼠相似，提示T淋巴细胞大量浸润的可能性较低。

**结论部分翻译**：伴有继发性IP SL2肿瘤的DBA/2小鼠的生存期延长与独特的腹膜免疫格局相关，其特点是SPMs和DCs的积累。虽然单独巨噬细胞不足以控制肿瘤生长，但重复IP肿瘤攻击提示了全身性抗肿瘤活性的趋势。总之，这些发现强调了SPMs和DCs是与该模型中生存获益相关的突出细胞。