TNF超家族信号组合拮抗用于T细胞免疫抑制

《Frontiers in Immunology》：Combination antagonism of TNF superfamily signaling for T cell immunosuppression

　　

引言：肿瘤坏死因子（TNF）和TNF受体（TNFR）超家族包含47种蛋白质，调节免疫信号和T细胞共刺激。虽然TNF抑制剂是免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）的既定疗法，但其疗效受到原发性无应答和继发性疗效丧失的限制。临床前数据表明，TNF/TNFR成员表现出冗余和协同信号，促使了组合靶向策略。方法：研究人员使用整合的计算和实验方法，系统评估了TNF/TNFR组合作为潜在免疫耐受靶点。研究人员应用了一个基因优先级框架，整合了转录组学、遗传学、可药性和通路调控数据，为类风湿关节炎和炎症性肠病中的TNF/TNFR基因推导出疾病关联评分。基于这些评分和T细胞表达谱，研究人员优先选择了十个靶点，在混合淋巴细胞反应（MLR）测定中使用临床阶段和临床前药理抑制剂进行组合筛选。最有前景的组合的效果通过RNA测序进一步表征。结果：组合筛选确定了四种显著抑制T细胞产生IL-2和IFN-γ的药物组合：TNF+CD40L、TNF+OX40L、CD40L+OX40L和CD40L+LTβ/LIGHT。转录谱分析显示，这些组合广泛下调了在同种异体反应期间诱导的、与T细胞活化、增殖、分化和细胞因子产生相关的基因。值得注意的是，TNF和CD40L的共同抑制（阿达木单抗+达匹罗珠单抗）产生了最稳健的抑制，独特地下调了337个基因，这些基因富集于关键的T细胞活化通路，包括NF-κB和ERK1/2。讨论：这些发现表明，TNF/TNFR超家族成员的组合拮抗可以强效抑制同种异体T细胞反应，其中TNF+CD40L组合显示出特别强大和广泛的作用。结果支持将组合TNF/TNFR抑制作为难治性IMIDs患者潜在的耐受诱导治疗策略进行持续的临床前评估。

**研究背景与问题**
肿瘤坏死因子（TNF）及TNF受体（TNFR）超家族由47个蛋白组成，在免疫信号调控和T细胞共刺激中发挥关键作用。TNF抑制剂（TNFi）是免疫介导的炎症性疾病（IMIDs）的标准化疗，但面临原发性无应答和继发性失效的局限性。临床前证据表明，TNF/TNFR成员间存在冗余和协同信号，提示单一靶点抑制可能不足以克服免疫网络的代偿机制。因此，研究人员旨在系统评估TNF/TNFR组合靶向作为免疫耐受诱导策略的潜力，以解决难治性IMIDs的治疗需求。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。

**研究方法**
研究人员采用整合计算与实验的策略。首先，利用基因优先级框架（GP&TE）整合转录组学（来自ArchS4数据库、GEO数据库及内部RNA-Seq数据）、遗传学（GWAS数据）、可药性（Fang等）、通路调控（CytoReason）和文本挖掘（Open Targets）等多维数据，通过desirability函数转化为统一的疾病关联评分，针对类风湿关节炎（RA）和炎症性肠病（IBD）两种T细胞驱动的IMIDs对47个TNF/TNFR基因排序。基于评分及T细胞（CD3+）基础/活化诱导表达谱，优先选择10个靶点（TNF、LTA、LTB、TL1A、OX40、CD40L、GITR、4-1BB、CD30、LIGHT）。在混合淋巴细胞反应（MLR）中，使用临床阶段和临床前药理抑制剂（如阿达木单抗、达匹罗珠单抗、阿米特利单抗、巴米那西普等），以50nM固定剂量进行组合筛选，通过ELISA和MSD检测IL-2和IFN-γ，并通过RNA-Seq分析转录组效应。样本来源：人类PBMC来源于leukopaks（StemCell Technologies），CD3+ T细胞和CD3-细胞分离后用于MLR，刺激-应答对来自不同供体。

**研究结果**
**1. Computational gene prioritization of TNF/TNFR targets relevant to inflammatory disease and T cell activation**
通过GP&TE框架生成RA和IBD的疾病关联评分，并与Open Targets和Data4Cure数据验证一致性。RNA-Seq显示，TNFRSF14（HVEM）和TNFRSF25（DR3）在静息T细胞中组成性表达，而TNF、LTA、LTB、TNFRSF4（OX40）、CD40LG（CD40L）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB）和TNFRSF18（GITR）在T细胞活化后显著上调。基于此，优先选择10个靶点进行组合筛选。

**2. MLR combination screen identifies four potent TNF/TNFR combinations that suppress T cell activation**
在MLR中，单药处理中阿达木单抗（α-TNF）、达匹罗珠单抗（α-CD40L）和阿米特利单抗（α-OX40L）显著降低IL-2和IFN-γ。组合处理中，阿达木单抗+达匹罗珠单抗（TNF+CD40L）产生最强的细胞因子抑制，效果与阳性对照CTLA4-Fc相当；达匹罗珠单抗+巴米那西普（CD40L+LTβ/LIGHT）、阿达木单抗+阿米特利单抗（TNF+OX40L）和达匹罗珠单抗+阿米特利单抗（CD40L+OX40L）也显著抑制细胞因子。增殖实验显示，含达匹罗珠单抗的组合显著降低CD3+细胞扩增指数，其中阿达木单抗+达匹罗珠单抗还显著降低细胞分裂比例。等摩尔剂量-反应实验证实，阿达木单抗+达匹罗珠单抗和达匹罗珠单抗+阿米特利单抗的IC50更低、最大抑制更强。

**3. TNF/TNFR combinations downregulate MLR-upregulated genes in T cells**
RNA-Seq分析显示，与无药对照相比，组合处理下调的差异表达基因（DEGs）数量远多于单药处理。阿达木单抗+达匹罗珠单抗下调524个基因，达匹罗珠单抗+阿米特利单抗下调251个，达匹罗珠单抗+巴米那西普下调240个，阿达木单抗+阿米特利单抗下调199个，而CTLA4-Fc下调387个。组合处理显著下调MLR诱导的细胞毒性效应分子（GZMA、GZMB、PRF1）、活化标志物（IL12RB2、CD38）和趋化因子受体（CCR5）等。基于212个MLR和α-CD3/α-CD28共同上调基因构建的炎症指数显示，阿达木单抗+达匹罗珠单抗、达匹罗珠单抗+阿米特利单抗和达匹罗珠单抗+巴米那西普显著降低炎症指数。阿达木单抗+达匹罗珠单抗独特下调337个基因（占其下调总基因的64.3%），包括IL2RA、NFATC4、MKI67等关键T细胞活化/增殖调控因子。基因本体（GO）富集分析显示，该组合下调的基因显著富集于免疫细胞趋化、II型干扰素产生、IL-2和IL-12产生、CD4+ αβ T细胞活化/分化/增殖以及NF-κB、ERK1/2、Ras信号通路，而其他组合的富集程度相对较弱。

**讨论与结论**
研究人员指出，多种TNF/TNFR组合已进入临床开发，如TNF×OX40L双特异性纳米抗体brivekimig在化脓性汗腺炎IIa期试验中显示疗效。本研究通过数据驱动框架系统筛选出四种强效组合，其中TNF+CD40L（阿达木单抗+达匹罗珠单抗）在抑制同种异体T细胞反应方面效果与CTLA4-Fc相当，且可能作用于T细胞活化的不同阶段（TNF早期效应、CD40L早期共刺激、OX40L后期延长存活、LTβR后期DC共刺激）。该研究存在局限性，如MLR模型无法完全模拟体内复杂细胞因子环境，且TL1A组合效果有限可能因缺乏TL1A诱导条件。未来需在GvHD人源化小鼠模型等体内模型中验证，并评估安全性及Treg功能影响。结论：靶向TNF/TNFR轴的组合拮抗（尤其是TNF+CD40L）可强效抑制同种异体T细胞反应，为开发双特异性抗体或优化共抗体配方以恢复难治性IMIDs患者的持久免疫耐受提供了有力支持。