《Frontiers in Immunology》：Generation and characterization of an anti ITGB4 monoclonal antibody that blocks Zika virus entry
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寨卡病毒（ZIKV）会导致先天性疾病和神经系统并发症，然而目前尚无获批的疫苗或抗病毒药物。整合素β4（ITGB4）已被鉴定为ZIKV的侵入受体。研究人员利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达了重组人ITGB4胞外结构域，并将其用于免疫BALB/c小鼠。通过杂交瘤筛选技
寨卡病毒（ZIKV）会导致先天性疾病和神经系统并发症，然而目前尚无获批的疫苗或抗病毒药物。整合素β4（ITGB4）已被鉴定为ZIKV的侵入受体。研究人员利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达了重组人ITGB4胞外结构域，并将其用于免疫BALB/c小鼠。通过杂交瘤筛选技术鉴定出单克隆抗体7C3。采用生物膜干涉技术（BLI）测定了其与ITGB4的结合亲和力。通过竞争结合实验评估了7C3与既往报道的抗ITGB4抗体13H10之间的表位关系。在四种细胞系中，通过RT-qPCR定量抗体预处理和病毒攻击后细胞相关性ZIKV RNA的量，评估了其抗病毒活性。7C3以皮摩尔级的亲和力（KD=30.9 pM）结合ITGB4，并具有高特异性。竞争结合实验表明，7C3和13H10（KD=7.98 pM）识别ITGB4上不重叠的表位。与磷酸盐缓冲液（PBS）和同型对照组相比，7C3预处理显著降低了这四种细胞系中细胞相关性的ZIKV RNA。第二种独立产生的具有皮摩尔级亲和力的抗ITGB4抗体能够在多种细胞类型中稳固阻断ZIKV侵入，包括与先天性神经病理学相关的SY5Y神经母细胞瘤细胞。7C3和13H10不重叠的表位提示其具有增强ITGB4阻断的联合策略潜力。7C3可变区的高胚系一致性（VH=94.46%，VL=95.82%）支持了其未来的人源化改造。这些发现确立了7C3作为一种针对宿主的抗病毒候选药物的地位，并为针对先天性ZIKV疾病的ITGB4靶向方法奠定了基础。
研究背景与意义：寨卡病毒是一种由蚊子传播的黄病毒，孕期感染可导致小头症、宫内生长受限和胎儿流产等严重先天性并发症，同时也会在成人中引发格林-巴利综合征等神经系统疾病。尽管医学界在理解ZIKV发病机制方面取得一定进展，但目前尚无广泛获批的疫苗或特异性抗病毒药物，因此迫切需要新型治疗策略。ZIKV的侵入是一个多步骤过程，依赖于多种宿主表面分子；其中，整合素β4（ITGB4，一种介导细胞黏附和信号传导的跨膜受体蛋白）已被证实是介导病毒高亲和力附着且在多种细胞类型感染中功能必需的侵入受体。既往研究表明，抗ITGB4抗体能够阻断病毒附着并保护孕鼠及胎儿。然而，针对ITGB4的抗体的治疗潜力仍未被充分挖掘。相较于直接靶向病毒蛋白容易诱发病毒逃逸突变，靶向宿主保守受体的抗体能大幅降低耐药风险，且避免了某些黄病毒疗法中存在的抗体依赖性增强（ADE）效应。因此，开展此项研究以开发全新高亲和力的阻断型抗体，对于防控先天性ZIKV感染具有重要的医学意义。该论文发表在《Frontiers in Immunology》期刊上。研究人员假设，使用纯度极高且正确折叠的ITGB4胞外结构域进行免疫，能够产生卓越亲和力并具备广泛阻断活性的单克隆抗体。
主要关键技术方法：研究人员利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达和纯化了重组人ITGB4胞外结构域，并将其免疫BALB/c小鼠（实验动物获内蒙古农业大学伦理委员会批准）。随后采用标准杂交瘤技术融合小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞并进行筛选以产生单克隆抗体。通过生物膜干涉技术（BLI）测定抗体结合亲和力，利用基于荧光信号的竞争结合实验鉴定抗体表位关系，并在四种细胞系中通过反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）靶向病毒E基因定量细胞相关性病毒RNA以评估抗体的病毒侵入抑制活性。
研究结果：
ITGB4胞外域的表达与纯化：通过镍亲和层析和体积排阻色谱（SEC）纯化，ITGB4胞外域在72 mL处洗脱出单一尖峰，对应表观分子量约为160 kDa，提示其在溶液中以同源二聚体形式存在。SDS-PAGE分析显示一条纯度大于95%的单体主带（约82 kDa）。
杂交瘤免疫、筛选及单克隆抗体产生：经过四轮免疫后，小鼠血清表现出高滴度免疫反应。研究人员将反应最强的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA法筛选并经两轮有限稀释亚克隆化，最终获得一株具有最高滴度且分泌IgG/kappa型抗体的稳定克隆，命名为7C3。
7C3序列、特异性及表位表征：免疫球蛋白可变区测序与IMGT分析显示，7C3的重链可变区（VH=94.46%）和轻链可变区（VL=95.82%）保持了极高的鼠胚系一致性，表明其经历了有限的体细胞高频突变。纯化后的7C3呈现标准的IgG重链（55 kDa）和轻链（27 kDa）结构，确证了高纯度。
7C3以高亲和力结合ITGB4：生物膜干涉分析表明，7C3以30.9 pM的解离常数（KD）高特异性结合ITGB4。在竞争结合实验中，发现未标记的7C3不与Cy5标记的13H10竞争结合表位，两者在整个测试浓度范围内的结合曲线高度重叠，表明两者识别ITGB4上完全独立或不重叠的表位。
7C3阻断ZIKV侵入细胞：在感染抑制实验中，研究人员在A549、Huh-7、BHK-21和SY5Y四种细胞系中预先加入7C3孵育后再进行ZIKV攻击。结果证实，与PBS及同型对照组相比，7C3预处理使所有评估细胞系中的细胞相关性ZIKV RNA显著降低，表现出了极强且一致的病毒侵入阻断能力。
讨论与研究结论总结：研究人员总结并得出结论，此研究成功开发并表征了靶向ITGB4胞外域的第二种独立单克隆抗体7C3，其凭借皮摩尔级的高亲和力稳固阻断了ZIKV在多种细胞（尤其是与先天性神经病理高度相关的SY5Y神经母细胞瘤细胞）中的侵入。7C3与13H10识别不重叠表位的重要发现，为未来设计双抗体联合鸡尾酒疗法以最大限度地阻断病毒附着提供了理论基础。此外，7C3可变区极高的胚系同源性意味着其介导高亲和力所需的互补决定区（CDR）框架主要由胚系基因编码，极大便利了未来该抗体的人源化改造。结合ZIKV易感染人神经祖细胞和胎盘滋养层细胞的特性，靶向宿主受体避免了直接的病毒突变选择压力。总而言之，7C3作为一种靶向宿主的高亲和力抗病毒候选药物，为对抗先天性ZIKV感染及相关神经病变的联合靶向干预策略确立了坚实基础。
