《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A single-cell sequencing-based prognostic model reveals HLA-DRA, NPC2, and PRPF38B as immune-regulatory tumor suppressors in non-small cell lung cancer
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背景：非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见肺癌亚型，因早期无症状且5年生存率低成为癌症死亡主因，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在肿瘤微环境（TME）中对NSCLC进展与预后的作用关键但未明。方法：研究人员分析GEO（GSE148466）单细胞RNA测序数据、TCG
背景：非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见肺癌亚型，因早期无症状且5年生存率低成为癌症死亡主因，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在肿瘤微环境（TME）中对NSCLC进展与预后的作用关键但未明。方法：研究人员分析GEO（GSE148466）单细胞RNA测序数据、TCGA中NSCLC相关数据及GEO（GSE50081）基因表达数据，采用LASSO回归构建9基因TIL相关风险评分模型（含HLA-DRA、NPC2、PRPF38B、PABPC1、ENO1、ANXA2、LGALS1、S100A10、SRGN），通过Kaplan-Meier与ROC分析评估预后价值并外部验证；利用TISIDB分析免疫浸润与调控因子，GSVA与GSEA分析通路关联，RT-qPCR、Western blotting及共培养实验验证HLA-DRA、NPC2、PRPF38B功能。结果：TILs在吸烟与非吸烟NSCLC样本中均丰富；9基因风险模型有效分层生存，高危患者预后差且富集促瘤免疫特征与通路，伴M0巨噬细胞与活化NK细胞增多及免疫检查点升高；过表达HLA-DRA、NPC2、PRPF38B抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，增强凋亡并抑制M2巨噬细胞极化。结论：本研究建立NSCLC的TIL基预后风险模型，认定HLA-DRA、NPC2、PRPF38B为具肿瘤抑制功能的免疫调控治疗靶点，为NSCLC精准免疫治疗提供新见解。
研究背景与立项依据
非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例85%以上，因早期症状隐匿导致多数患者确诊即晚期，即便联合免疫治疗与靶向治疗，5年生存率仍不理想。肿瘤微环境（TME）由肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞及细胞外基质构成，其中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）对NSCLC免疫调控具有双向作用：一方面可激活抗肿瘤免疫杀伤肿瘤细胞，另一方面易被肿瘤逃逸机制削弱功能并诱导免疫耐受。既往研究虽证实TILs丰度与NSCLC生存相关，但其亚群异质性、特征基因如何转化为预后工具仍待阐明。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术可解析TILs亚群激活状态与独特基因表达，但如何基于TIL特征基因构建可靠预后模型并实验验证关键基因功能，是推进NSCLC精准免疫治疗的核心缺口。该研究发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》，旨在整合多队列生物信息学与湿实验，建立TIL基风险评分模型并锁定具免疫调控作用的肿瘤抑制基因。
主要关键技术方法
研究人员下载GSE148466（3例scRNA-seq）、TCGA（1153例NSCLC bulk RNA-seq配生存信息）、GSE50081（127例芯片表达）三类队列；以Seurat进行单细胞质控、Harmony批次校正、UMAP聚类与CellMarker注释，Wilcoxon检验筛选TILs差异基因（|log2FC|≥0.5，FDR<0.05）；将1247个TIL关联基因入LASSO Cox回归（10折交叉验证，随机种子1–30000做4:1训练测试拆分）定9基因签名；CIBERSORT（LM22）反卷积免疫浸润，TISIDB查检查点与趋化因子，GSVA/GSEA（MSigDB Hallmark与KEGG）做通路分析，pRRophetic联GDSC预测化疗IC50；湿实验以RT-qPCR、Western blotting、EdU、Transwell、流式凋亡、ELISA及THP-1共培养验证HLA-DRA、NPC2、PRPF38B功能。
研究结果
3.1 单细胞解析NSCLC微环境细胞组成：对GSE148466质控保留4080细胞，UMAP分18簇并注释8类，TILs在吸烟者（约60%）与非吸烟者（约50%）均占主导，确立TILs为NSCLC免疫微环境核心组分。
3.2 LASSO构建风险评分及预后预测：训练集选9基因，风险评分=HLA-DRA×(?0.1446)+NPC2×(?0.1078)+PRPF38B×(?0.0859)+PABPC1×0.0467+ENO1×0.0531+ANXA2×0.0592+LGALS1×0.0691+S100A10×0.1115+SRGN×0.1246；KM显示高危总生存（OS）显著差（P<0.05），1/3/5年AUC 0.65–0.71，GSE50081外部验证同效，模型稳健。
3.3 风险评分与临床指标关联：评分死于患者、高侵袭、男性、高Stage/N期显著升高（P<0.05），单多因素Cox证其为独立预后因子（HR>1，P<0.001）。
3.4 风险评分调控免疫微环境机制：高危组M0巨噬细胞与活化CD4记忆T细胞增多，活化NK与CD8+ T减；CTLA4、PDCD1、TGFBR1等抑制分子及CD276、IL6上调，提示免疫耗竭与耐受态。
3.5 化疗敏感性与通路：pRRophetic示高危与axitinib、cytarabine、AKT抑制剂VIII等IC50相关（P<0.05）；GSVA/GSEA富集MTORC1、P53、PI3K-AKT-mTOR、DNA复制与细胞周期，关增殖存活与耐药。
3.6 非编码RNA与转录因子网络：miRcode预测80 miRNA-214互作，RcisTarget示NFYA（motif cisbp-M3628）NES 6.79为顶调控TF。
3.7 列线图与长期生存：整合年龄性别分期与风险评分建列线图，校准曲线贴合，2/3年AUC 0.605/0.622，DCA净获益高。
3.8 模型基因微环境表达：HLA-DRA富集免疫抗原呈递（TILs/巨噬细胞），NPC2富集脂代谢，PRPF38B广布各细胞涉RNA剪接；AUCell示HLA-DRA负向免疫通路、NPC2正向代谢、PRPF38B正向增殖。
3.9 三基因在NSCLC细胞系下调：BEAS-2B对照H1299/A549/HCC827，RT-qPCR/WB/IF证HLA-DRA、NPC2、PRPF38B mRNA蛋白均低表达。
3.10 过表达抑瘤：pc载体转染H1299/A549，EdU与Transwell降增殖迁移侵袭，流式升凋亡，WB降Bcl-2/MMP2/MMP9/KI-67/PCNA、升Bax；敲低反向。
3.11 免疫调控抑M2极化：过表达降TGF-β/IL-10/IL-13分泌，共培养THP-1后ARG1（PCR/IF）降，CD163/CD206蛋白降、iNOS/TNF-α升，阻M2极化，HLA-DRA效最强。
讨论与结论翻译
讨论指出，9基因模型含HLA-DRA（抗原呈递）、NPC2（代谢重编程）、PRPF38B（RNA剪接）等具保护功能；风险评分串联P53、PI3K-AKT-mTOR与细胞周期通路，解释高危组免疫检查点升、M0巨噬积聚与CD8+ T耗竭致预后差；模型在TCGA/GEO稳建，AUC>0.65，且关联化疗耐药。局限为缺体内验证与PRPF38B剪接机制未深究。结论：本研究建立NSCLC的TIL基预后风险模型，识别HLA-DRA、NPC2与PRPF38B为具肿瘤抑制功能的免疫调控治疗靶点，深化分子层面对NSCLC免疫微环境理解，为精准免疫治疗提供新视角。
