cGAS武装的溶瘤腺病毒激活STING通路并增强肺癌抗肿瘤免疫，与PD-L1疗法联合具有优越疗效

《Frontiers in Immunology》：Oncolytic adenovirus armed with cGAS activates STING pathway and enhances antitumor immunity in lung cancer with superior combined efficacy of PD-L1 therapy

　　

引言：非小细胞肺癌（NSCLC）患者中STING（干扰素基因刺激因子，STING）的广泛表达与总生存期等因素密切相关。激活STING通路可抑制NSCLC。然而，STING激动剂的临床转化仍受到脱靶效应、代谢不稳定性和药代动力学欠佳等挑战的阻碍。方法：在本研究中，研究人员利用hTERT启动子调控的Ad5/3嵌合腺病毒平台，构建了两种分别表达人源或鼠源cGAS（环状GMP-AMP合酶，cGAS）的溶瘤腺病毒（OAds），即OAd-HcGAS和OAd-McGAS，以评估携带cGAS基因的溶瘤病毒（OVs）是否能够在肿瘤内特异性激活STING通路，并在体外和体内增强OVs的抗肿瘤疗效。结果：体外实验显示，OAd-HcGAS在肿瘤细胞中表现出强效复制和细胞溶解活性。它激活了STING–TBK1–IRF3信号轴，引发强烈的I型干扰素（IFN-I）和促炎细胞因子反应，且不影响病毒复制。在小鼠Lewis肺癌同种异体移植模型中，瘤内（i.t.）注射OAd-McGAS导致cGAS大量表达并随之激活STING通路。此外，与抗PD-L1疗法联合使用，半数以上病例出现肿瘤消退。值得注意的是，这种武装溶瘤病毒策略增强了多种免疫细胞群的活化和浸润。讨论：综上所述，这些发现确立了表达cGAS的溶瘤腺病毒作为肺癌治疗的一种新颖有效策略。

**论文解读：cGAS武装的溶瘤腺病毒通过激活STING通路增强肺癌抗肿瘤免疫并协同PD-L1疗法**

**研究背景与问题**

肺癌，尤其是非小细胞肺癌（NSCLC），是全球癌症死亡的主要原因之一。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）在实体瘤治疗中展现出潜力，但约70%的NSCLC患者因肿瘤微环境（TME）限制和PD-L1表达差异而未能获益。溶瘤腺病毒（OAds）凭借高基因转导效率、可控复制及诱导免疫原性细胞死亡的能力，成为肺癌免疫治疗的新策略。cGAS-STING通路作为关键的胞质DNA传感机制，能激活先天和适应性免疫，但STING激动剂存在脱靶效应、代谢不稳定及药代动力学欠佳等问题，限制了其临床应用。因此，研究人员旨在开发一种能够实现肿瘤特异性STING通路激活的溶瘤病毒策略，以克服上述局限。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

**研究内容与结论**

研究人员利用基于hTERT启动子调控的Ad5/3嵌合腺病毒平台，构建了两种分别表达人源cGAS（OAd-HcGAS）和鼠源cGAS（OAd-McGAS）的溶瘤腺病毒，并共表达GM-CSF。体外实验证实，OAd-HcGAS在NCI-H226细胞中有效复制、裂解细胞，并激活STING–TBK1–IRF3信号轴，诱导I型干扰素（IFN-I）和促炎细胞因子分泌，同时不损害病毒复制。在NCI-H226双侧异种移植模型中，OAd-HcGAS瘤内注射显著抑制治疗侧肿瘤生长。在Lewis肺癌（LLC）同种异体移植模型中，OAd-McGAS治疗侧肿瘤显著缩小，并观察到远处效应（abscopal effect）。进一步研究发现，OAd-McGAS激活STING通路，增强肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的浸润和杀伤活性。联合抗PD-L1治疗导致半数以上小鼠肿瘤消退，肿瘤抑制率达95.22%，并显著增加脾脏CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例。该研究证明cGAS武装的溶瘤腺病毒是一种新颖有效的肺癌治疗策略。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键方法：1）基于Ad5/3嵌合平台和hTERT启动子构建重组溶瘤腺病毒（OAd-HcGAS和OAd-McGAS），通过P2A连接子将cGAS与E1B55k融合；2）利用透射电镜（TEM）鉴定病毒形态，免疫斑法测定病毒滴度；3）通过CCK-8和结晶紫染色评估细胞毒性，Western blot检测STING通路蛋白磷酸化，ELISA检测细胞因子和趋化因子；4）Transwell实验评估淋巴细胞迁移，共培养系统结合流式细胞术分析免疫细胞活化；5）建立C57BL/6小鼠双侧LLC皮下同种异体移植模型和BALB/c-nu裸鼠NCI-H226模型，进行瘤内注射治疗；6）采用免疫组化、免疫荧光、流式细胞术和定量PCR分析肿瘤组织中的蛋白表达、免疫细胞浸润及病毒分布。

**研究结果**

**1. 表达人源和鼠源cGAS的溶瘤病毒的构建**
通过TIMER 3.0数据库分析发现STING在肿瘤和正常细胞中广泛表达，提示需要肿瘤特异性递送。研究人员成功构建了OAd-HcGAS和OAd-McGAS，电镜证实典型腺病毒形态。在HEK 293细胞中，两者复制动力学与OAd-Z2相当，说明cGAS和GM-CSF插入不影响病毒复制。ELISA和Western blot验证了GM-CSF和cGAS的表达。

**2. OAd-HcGAS不仅杀死肿瘤细胞，还激活cGAS-STING通路**
CCK-8和结晶紫染色显示，OAd-HcGAS在多种肿瘤细胞中呈时间和剂量依赖性杀伤，且溶瘤效果与OAd-Z2相当。在NCI-H226细胞中，OAd-HcGAS感染后pTBK1、pIRF3、IFN-β、CXCL10、CXCL9、TNF-α及干扰素刺激基因（IFIT1、IFIT3）表达显著升高，而STING抑制剂H-151可抑制该激活。病毒复制检测显示，OAd-HcGAS在NCI-H226细胞中复制良好，且STING激活并未显著削弱复制效率。

**3. OAd-HcGAS在体外激活并招募免疫细胞**
Transwell实验证实，OAd-HcGAS感染的NCI-H226细胞上清液能显著促进淋巴细胞迁移。在共培养体系中，OAd-HcGAS感染肿瘤细胞后，CD8⁺ T细胞和NK细胞表面CD69表达及IFN-γ分泌增加，LDH释放和结晶紫染色显示肿瘤细胞杀伤增强。此外，OAd-HcGAS感染上调了PD-L1蛋白表达，为联合免疫检查点抑制剂提供了理论依据。

**4. OAd-HcGAS对NCI-H226肺癌的体内抑制作用**
在BALB/c-nu小鼠双侧NCI-H226模型中，瘤内注射OAd-HcGAS后治疗侧肿瘤体积显著小于OAd-Z2组和PBS组，抑制率达65.81%，而未治疗侧肿瘤体积组间无显著差异，表明局部治疗效果。

**5. OAd-McGAS增强抗肿瘤疗效并激活体内cGAS-STING通路**
在C57BL/6小鼠双侧LLC模型中，OAd-McGAS治疗侧肿瘤体积从第4天起显著小于OAd-Z2组，抑制率达79.55%，未治疗侧抑制率为58.24%。免疫组化和Western blot证实OAd-McGAS治疗侧肿瘤中pTBK1、pIRF3及下游蛋白（CXCL10、IFIT1、IFIT3、TNF-α、IFN-γ）表达升高，且体外LLC细胞中pSTING、pTBK1、pIRF3水平增加。病毒在肿瘤组织中复制良好，且未引起明显肝损伤或体重下降。

**6. OAd-McGAS治疗显著增加肿瘤浸润淋巴细胞**
流式细胞术分析显示，OAd-McGAS组治疗侧和未治疗侧肿瘤中CD8⁺ T细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）数量增加，而常规树突状细胞（cDCs）增加不显著，NK细胞无变化。免疫荧光进一步证实CD8⁺ T细胞密度升高。TILs杀伤实验表明，OAd-McGAS治疗组TILs对LLC-EGFP靶细胞具有更强的裂解能力。

**7. OAd-McGAS与抗PD-L1联合疗法在体内展现出强效抗肿瘤疗效**
联合治疗实验中，OAd-McGAS（瘤内注射）联合抗PD-L1抗体（腹腔注射）显著增强疗效，5只小鼠中3只肿瘤消退，抑制率达95.22%。流式细胞术显示，联合治疗组脾脏中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞比例显著增加，而NK细胞比例无变化。

**讨论与结论**

讨论部分指出，cGAS-STING通路激活后能促进肿瘤特异性CD8⁺ T细胞活化和适应性免疫，但STING激动剂临床应用受限。研究人员通过瘤内递送cGAS武装的OAds实现了局部STING激活，且不损害病毒复制，这可能与腺病毒E1A蛋白抑制宿主抗病毒反应及病毒DNA在核内复制有关。Ad5/3嵌合纤维可有效感染LLC细胞，且cGAS武装的OAds能重塑TME，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，并通过联合PD-L1阻断优化疗效。远处效应依赖于系统性抗肿瘤免疫的激活，在免疫功能健全小鼠中观察到，而在免疫缺陷小鼠中未出现。研究局限性包括未在正常细胞中验证选择性、未建立cGAS-STING因果关系的体内证据、未单独评估GM-CSF和cGAS的贡献。研究结论：研究人员构建了共表达cGAS和GM-CSF的溶瘤腺病毒OAd-HcGAS和OAd-McGAS，与PD-L1抗体联合展现出强效抗肿瘤疗效，为肺癌治疗提供了新策略。后续研究将进一步优化载体，阐明STING激活后病毒高效复制的分子机制，为下一代溶瘤病毒疗法奠定基础。