Zn(II)2Cys6转录因子VdRgt1影响烟树黄萎病菌大丽轮枝菌的微菌核发育、致病力与葡萄糖利用

《Phytopathology Research》：A Zn(II)2Cys6 transcription factor VdRgt1 affects microsclerotia development, virulence, and glucose utilization in the smoke tree wilt fungus Verticillium dahliae

　　

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是一种土传维管束病原菌，具有广泛的寄主范围，并能够通过形成抗逆性的微菌核在土壤中长期存活。该病原菌给病害治理带来重大挑战，并且在中国经常引起烟树（Cotinus coggygria）严重黄萎病。Zn(II)₂Cys₆转录因子（TFs）是真菌中一类主要的调控因子，参与多种生物学过程，包括初级与次级代谢、胁迫适应以及致病过程。本研究发现，属于Zn(II)₂Cys₆转录因子的VdRgt1缺失后，会导致菌丝形态异常、营养生长减弱、分生孢子产量显著下降，并改变微菌核发育与黑色素积累的时间进程。此外，ΔVdRgt1突变体的致病力显著降低，且对烟树的定殖能力受损。转录组分析表明，VdRgt1参与碳水化合物代谢和能量代谢的调控。与此一致，ΔVdRgt1突变体的三磷酸腺苷（ATP）水平降低，反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）结果进一步支持VdRgt1在葡萄糖应答基因调控中的作用。综上，这些结果表明，VdRgt1是大丽轮枝菌中的一个重要调控因子，协调菌丝发育、微菌核发育与黑色素积累的时间进程、碳代谢与能量代谢、胁迫适应及致病力。

该论文发表于《Phytopathology Research》，聚焦于土传维管束病原真菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中Zn(II)₂Cys₆型转录因子VdRgt1的功能鉴定及其在发育、代谢与致病中的综合调控作用。大丽轮枝菌寄主范围极广，能够依靠抗逆性极强的微菌核在土壤中长期存活，是引发黄萎病的重要病原。对烟树（Cotinus coggygria）而言，该病原菌在中国多地造成严重危害。由于微菌核赋予病原菌长期生存能力，常规轮作等防控措施往往难以奏效，因此解析其发育与致病调控网络，对理解病原生物学及寻找防控靶点具有重要价值。

现有研究已表明，转录因子（TFs）在真菌生长发育、环境应答和寄主侵染中具有核心调控作用，但大丽轮枝菌中大量转录因子的具体功能仍不清楚。Zn(II)₂Cys₆家族是真菌特异性较强的一类转录调控因子，已在多种植物病原真菌中被证明参与分生孢子形成、黑色素合成、营养代谢、侵染相关发育和毒力调控。然而，在大丽轮枝菌中，这一类转录因子的功能挖掘仍较为有限。基于此，研究人员鉴定了大丽轮枝菌基因VDAG_07458编码的Zn(II)₂Cys₆转录因子，并命名为VdRgt1，系统分析其在菌丝生长、分生孢子形成、微菌核发育、黑色素积累、胁迫适应、碳源利用和致病力中的作用。

研究人员首先通过序列比对与结构域分析确认VdRgt1具有典型Zn(II)₂Cys₆ DNA结合结构域和TF_MHR结构域，并构建了VdRgt1缺失突变体ΔVdRgt1及回复菌株ΔVdRgt1-C。表型分析显示，VdRgt1缺失后，菌落生长明显减弱，菌落边缘呈不规则锯齿状，显微观察可见菌丝膨大和变形，提示菌丝伸长受阻。同时，突变体分生孢子产量显著下降，而孢子形态本身无明显异常。回复菌株则基本恢复野生型表型，说明VdRgt1对于正常营养生长和产孢具有必要作用。

在微菌核与黑色素相关发育方面，研究发现VdRgt1并非决定微菌核是否形成的绝对必需因子，而是关键的时间调控因子。于诱导条件下，ΔVdRgt1在早期未能按时形成可见微菌核和黑色素沉积，而野生型和回复菌株已进入微菌核黑化阶段；至后期，突变体最终仍能形成正常着色的微菌核。与这一延迟表型相一致，多个已知与微菌核发育相关的基因在4 dpi时于突变体中显著下调，而在8 dpi时恢复至接近或高于野生型水平。另一方面，在菌落发育较晚阶段，ΔVdRgt1的黑色素化面积反而显著大于野生型，表明VdRgt1对黑色素积累具有阶段性双重影响，即促进早期适时启动，但限制后期过度积累。

在致病相关性状分析中，研究人员区分了穿透与定殖两个层面。纤维素薄膜穿透实验显示，ΔVdRgt1仍能够形成类似穿透钉的结构，并在去膜后继续生长，说明VdRgt1对初始穿透能力并非必需。然而，在烟树幼苗根蘸接种试验中，ΔVdRgt1引起的症状发展明显延迟、病情指数降低，说明其致病力显著减弱。进一步的病原再分离和qPCR定量表明，突变体虽然能够侵入植株，但在各检测时间点的体内真菌生物量均低于野生型，证明VdRgt1对寄主体内定殖和完全毒力具有重要贡献。

为解析VdRgt1调控网络，研究人员对野生型与ΔVdRgt1进行了RNA测序（RNA-seq）。共鉴定到436个差异表达基因，其中上调263个、下调173个。功能富集分析显示，上调基因主要涉及血红素结合、氧化还原活性及硝化胁迫相关过程；下调基因则富集于跨膜转运、甘油磷脂分解、单酰基甘油分解及次级代谢生物合成等过程。KEGG分析进一步表明，受VdRgt1影响的通路集中于嘌呤代谢、丙酮酸代谢、三羧酸循环（TCA循环）以及半乳糖代谢、脂肪酸降解、赖氨酸降解等，提示其与中心碳代谢和能量代谢密切相关。

在胁迫应答方面，结合转录组结果，研究人员检测了细胞壁和细胞膜相关胁迫耐受性。结果显示，ΔVdRgt1在刚果红（CR）、calcofluor white（CFW）和十二烷基硫酸钠（SDS）处理下的生长抑制率低于野生型，表现出更高的细胞壁和膜胁迫耐受性；但在H₂O₂氧化胁迫下，突变体与野生型敏感性相近。这说明VdRgt1选择性参与细胞壁与细胞膜相关胁迫应答，而非主要介导氧化胁迫耐受。论文同时指出，这一增强耐受表型的具体机制尚未被直接验证，但与几丁质相关代谢通路上调相一致。

围绕碳源利用，研究进一步揭示了VdRgt1的重要代谢功能。差异表达基因在碳水化合物代谢类通路中富集最为显著，涉及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、TCA循环及乙醛酸-二羧酸代谢等。单一碳源培养实验显示，ΔVdRgt1在葡萄糖、蔗糖、果胶、淀粉和甘油等多种碳源条件下均生长受限，其中在葡萄糖和蔗糖上的缺陷最明显，尤以葡萄糖最为突出。进一步检测胞内ATP含量发现，在有糖和无糖条件下，突变体ATP水平都低于野生型与回复菌株；补加葡萄糖虽可提升突变体ATP含量，但提升幅度显著较小，表明VdRgt1参与葡萄糖相关能量积累过程。

为进一步验证VdRgt1与葡萄糖利用的联系，研究人员检测了多个推定葡萄糖转运蛋白基因的表达。RT-qPCR结果显示，在含葡萄糖培养条件下，VDAG_04203、VDAG_00974和VDAG_05443在ΔVdRgt1中显著下调，支持VdRgt1参与葡萄糖应答性基因调控，并可能通过影响葡萄糖转运相关基因表达来调节碳利用效率。

本研究采用的主要技术方法包括：基于BLASTP和结构域分析鉴定VdRgt1；以北京香山烟树来源的大丽轮枝菌野生型XS11为材料，利用农杆菌介导转化构建基因缺失与回复菌株；通过菌落生长、显微观察、产孢测定、微菌核与黑色素定量、细胞膜/细胞壁及氧化胁迫处理评价表型；采用烟树幼苗根蘸接种、病情指数评估、病原再分离和qPCR定量真菌生物量检测致病力与定殖；通过RNA-seq、GO/KEGG富集、ATP含量测定及RT-qPCR分析代谢与转录调控变化。

以下结合论文结果部分各小标题，对研究发现作进一步归纳。

VdRgt1 regulates hyphal growth and conidial production in V. dahliae
该部分通过基因敲除与回复实验明确，VdRgt1编码一个具有Zn(II)₂Cys₆特征结构域的转录因子。缺失VdRgt1后，菌落径向生长减慢，菌丝膨大变形，分生孢子产量显著下降，而回复后恢复正常，说明VdRgt1是维持菌丝正常形态、生长和产孢能力的重要调控因子。

VdRgt1 regulates the timing of microsclerotia development and melanin accumulation in V. dahliae
该部分通过基础培养基诱导、显微观察及相关基因表达分析表明，VdRgt1影响的是微菌核发育与黑色素积累的时间进程，而非这些过程本身是否发生。ΔVdRgt1在早期形成微菌核和黑色素沉积明显滞后，但后期能够恢复。相关发育基因在早期下调、后期回升，与表型高度一致。晚期黑色素化面积增加则说明VdRgt1还负向调控菌落后期黑色素过量积累。

VdRgt1 contributes to full virulence
该部分利用纤维素薄膜穿透实验和烟树接种实验显示，VdRgt1不是穿透钉形成的必要因子，但对病原在宿主体内的有效扩展和完全致病力至关重要。突变体致病症状减轻、进程延迟，且植株内真菌生物量持续偏低，表明其主要影响定殖效率和体内扩展能力。

Transcriptomic analysis of the ΔVdRgt1 mutant
该部分通过转录组测序揭示VdRgt1缺失引起广泛转录重编程。差异表达基因主要涉及氧化还原过程、应激应答、跨膜转运、脂质与碳代谢等，为解释其多重表型缺陷提供了分子依据，也说明VdRgt1属于上游综合性调控因子。

VdRgt1 selectively regulates responses to cell wall and membrane stress
该部分通过CR、CFW、SDS及H₂O₂处理分析得出，VdRgt1选择性参与细胞壁和细胞膜胁迫应答。VdRgt1缺失提高了对细胞壁干扰剂和膜损伤剂的耐受性，但不影响对氧化胁迫的敏感性，提示其调控范围具有特异性。

VdRgt1 is involved in carbohydrate utilization
该部分是全文机制关联最强的结果之一。研究通过碳源利用实验、ATP检测和葡萄糖转运相关基因表达分析证明，VdRgt1与碳源利用尤其是葡萄糖利用密切相关。突变体在多种碳源上生长减弱、ATP积累不足，并伴随多个推定葡萄糖转运蛋白基因下调，说明VdRgt1参与葡萄糖应答及能量代谢稳态维持。

讨论部分指出，VdRgt1作为酵母Rgt1的同源蛋白，在大丽轮枝菌中保留了葡萄糖响应调控特征，同时其功能范围明显扩展，进一步整合了发育、胁迫适应与致病过程。研究结果支持这样一种认识：碳感知、碳利用与能量代谢并非孤立过程，而是与菌丝延伸、分生孢子形成、微菌核启动、黑色素沉积以及寄主体内定殖紧密耦联。VdRgt1缺失所导致的多重缺陷，可能正反映了代谢稳态失衡对病原生活史各阶段的连锁影响。作者也明确指出，VdRgt1是否直接结合并调控葡萄糖转运基因及其他代谢靶基因，仍有待后续通过启动子结合分析、染色质免疫沉淀（ChIP）及代谢组学等手段进一步阐明。

研究结论部分可译为：本研究系统表征了大丽轮枝菌中的Zn(II)₂Cys₆转录因子VdRgt1。研究结果表明，VdRgt1通过调控包括葡萄糖转运蛋白基因在内的碳利用相关基因，在维持碳代谢和能量代谢稳态中发挥重要作用。通过这一调控功能，VdRgt1影响菌丝生长、分生孢子形成、微菌核发育、胁迫适应和致病力。功能分析进一步表明，VdRgt1缺失会破坏碳代谢及其相关发育过程，从而导致致病力显著下降。总体而言，这些结果将VdRgt1确定为调控真菌发育和寄主侵染的重要因子，并为理解植物病原真菌中Zn(II)₂Cys₆转录因子的功能分化提供了新的认识。鉴于其真菌特异性及对毒力的重要贡献，VdRgt1可能成为开发新型抗真菌策略的潜在靶标。