针对猪流行性腹泻病毒的中和纳米抗体：发现与表征

《BMC Veterinary Research》：Neutralizing nanobodies against porcine epidemic diarrhea virus: discovery and characterization

　　

猪流行性腹泻病毒（PEDV）导致仔猪严重死亡率，在全球范围内造成重大经济损失。纳米抗体（Nbs）在疾病干预方面比传统抗体具有显著优势。本研究旨在开发针对PEDV刺突（S）蛋白的中和Nbs。研究人员构建了编码CH-HB2-2018株S蛋白的真核质粒，并在HEK-293 F细胞中表达。在用纯化的S蛋白免疫羊驼后，构建了噬菌体展示文库。基于互补决定区（CDR）多样性，生物淘选获得了70个独特的Nbs，其中67个通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质印迹法（Western blot）确认是特异性结合物。使用免疫荧光（IFA）和流式细胞术进一步鉴定出9个特异性候选物。微量中和试验显示，这些候选物对Vero细胞中PEDV复制表现出不同程度的抑制。值得注意的是，纳米抗体3Nb17具有最高的结合亲和力和中和效价。这些发现突显了3Nb17作为开发新型PEDV诊断工具和治疗药物的有前景的候选物。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高度传染性的α冠状病毒（Alphacoronavirus），导致仔猪严重脱水和死亡，对全球养猪业造成巨大经济损失。尽管疫苗已广泛应用，但PEDV疫情仍频繁发生，主要原因是刺突（S）蛋白的快速遗传进化削弱了传统免疫预防的交叉保护效果。因此，亟需开发新型广谱稳定的抗病毒药物以补充现有防控策略。S蛋白是病毒嗜性和致病性的主要决定因素，包含两个亚基：S1负责结合猪小肠上皮细胞上的氨肽酶N（APN/CD13）受体，S2介导膜融合。与抗核衣壳（N）蛋白的抗体不同，S蛋白（尤其是S1亚基）含有关键的中和表位，但S蛋白高度糖基化并经历翻译后修饰，掩盖了关键表位。纳米抗体（Nbs）源自骆驼科动物重链抗体，具有小尺寸（~15 kDa）和长CDR3环，可访问被糖基屏蔽的保守表位，且稳定性高，适合开发为口服或气溶胶治疗剂。本研究旨在通过噬菌体展示技术开发针对PEDV S蛋白的中和纳米抗体。研究人员利用纯化的重组S蛋白免疫羊驼，构建了高多样性噬菌体展示文库，经严格生物淘选和功能鉴定，获得了一种新型纳米抗体3Nb17，其具有强中和活性和高亲和力。该候选物为开发下一代PEDV诊断试剂和治疗干预提供了有前景的基础。该论文发表在《BMC Veterinary Research》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：构建编码PEDV CH-HB2-2018株S蛋白的真核表达质粒（pCAGGS-PEDV-S，含gp67信号肽、T4 foldon三聚化标签和6×His标签），在HEK-293 F细胞中表达并纯化重组S蛋白；用纯化S蛋白（与MF59佐剂混合）皮下免疫羊驼（来源：秦皇岛野生动物园），4次免疫后分离外周血单核细胞（PBMCs）提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因库，克隆至pComb3XSS噬菌粒载体，电转化大肠杆菌TG1构建噬菌体展示文库（库容量1.0×10⁸ CFU）；通过三轮生物淘选（抗原包被浓度递减）富集特异性纳米抗体，利用周质提取物ELISA（PE-ELISA）筛选阳性克隆，基于CDR3多样性分析获得70个独特纳米抗体；将选定的纳米抗体在大肠杆菌WK6细胞中表达并纯化。

**研究结果**：

**重组PEDV S蛋白的制备**：通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）证实，重组S蛋白在HEK-293 F细胞中成功表达并纯化至高度均一性，还原条件下主要条带约180 kDa，与单体糖蛋白分子量一致，为后续免疫和筛选奠定了基础。

**免疫VHH文库的构建**：四次免疫后，羊驼血清抗PEDV S蛋白抗体滴度显著高于免疫前（图2A）。所构建噬菌体展示文库的多样性为1.0×10⁸ CFU，菌落聚合酶链式反应（PCR）检测24个随机克隆显示VHH基因插入效率为100%（图2B），表明文库质量高。

**PEDV特异性纳米抗体的筛选和鉴定**：经三轮生物淘选，筛选192个单菌落，通过PE-ELISA鉴定出106个阳性结合物。序列分析基于CDR3多样性获得70个独特纳米抗体，其中67个在大肠杆菌中可溶性表达并纯化至>90%均一性（图3A）。噬菌体ELISA验证这些纯化纳米抗体对S蛋白保持强结合活性（图3B）。

**选定纳米抗体的结合特异性**：选取18个高亲和力纳米抗体进一步表征。间接免疫荧光试验（IFA）显示，其中10个纳米抗体（包括3Nb17、3Nb20、3Nb40、3Nb62、3Nb71、3Nb72、3Nb77、3Nb87、3Nb118和3Nb124）能特异性识别PEDV感染Vero细胞中的天然病毒抗原，呈现明显的核周荧光（图4）。流式细胞术分析表明，其中9个纳米抗体能有效结合HEK293T细胞表面表达的S蛋白（图5），表现为双阳性细胞（FITC⁺/APC⁺）比例高。3Nb20呈弱阳性结合信号。

**3Nb17的中和效力和亲和力**：对9个强结合纳米抗体进行病毒中和试验，其中纳米抗体3Nb17表现出最有效的抗病毒活性，以剂量依赖性方式抑制PEDV诱导的细胞病变效应（CPE）（图6A）。3Nb17的半最大抑制浓度（IC₅₀）为0.0318 μg/mL。表面等离子共振（SPR）测定其结合动力学，显示3Nb17具有快速结合速率（K_on）和慢速解离速率（K_off），平衡解离常数（K_D）为0.568 nM（图6B），表明其高亲和力。

**讨论与结论**：讨论部分指出，PEDV的S蛋白高度糖基化，常规抗体难以进入保守表位，而纳米抗体凭借其凸出的互补位和长CDR3环可穿透糖基屏障。3Nb17的优异性能可能源于此。研究局限性包括仅针对单一PEDV基因型（GIIb）进行筛选，需评估其对其他株系的交叉中和能力；体内保护效力和药代动力学需在新生仔猪攻毒模型中验证；纳米抗体半衰期短，需开发半衰期延长形式（如融合白蛋白结合域或Fc区）。结论部分翻译如下：总之，研究人员建立了一个稳健的产抗病毒纳米抗体流程，并鉴定出3Nb17是PEDV的有效中和剂。凭借其卓越的亲和力、稳定性和在原核系统中的高产量，3Nb17代表了开发下一代诊断试剂盒和治疗干预的有前景的候选物。未来的冷冻电镜结构研究将进一步阐明其作用机制，为合理设计多价纳米抗体鸡尾酒以对抗病毒进化铺平道路。