《Acta Neuropathologica Communications》：Methylation profiling and alternative classification approaches in a glioma-enriched FFPE stereotaxic biopsy cohort
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中枢神经系统肿瘤的DNA甲基化谱分析支持并细化组织学诊断。肿瘤DNA甲基化特征允许与参考甲基化类别和分子分级所需的拷贝数谱进行对齐。总体而言，尤其是在立体定向活检（STX）等组织有限的情况下，需要有针对性地分诊到最有前景的分析技术。本研究探讨了STX样本中DN
中枢神经系统肿瘤的DNA甲基化谱分析支持并细化组织学诊断。肿瘤DNA甲基化特征允许与参考甲基化类别和分子分级所需的拷贝数谱进行对齐。总体而言，尤其是在立体定向活检（STX）等组织有限的情况下，需要有针对性地分诊到最有前景的分析技术。本研究探讨了STX样本中DNA甲基化谱分析和分子分级的诊断潜力与准确性。研究人员对237例患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行了DNA甲基化分析，包括海德堡（v11b4）、贝塞斯达（v2）和EpiDiP脑肿瘤分类器、拷贝数谱分析以及使用MethylCIBERSORT进行肿瘤去卷积。90.5%的样本（n=232）被分配了DNA甲基化类别，其中61.6%达到海德堡分类器评分>0.84。96.9%的病例中可检测到指示性拷贝数变异（CNV）。基于重复随机子采样的重采样验证支持的递归划分表明，脑肿瘤分类器依赖的最小分析物输入量以达到稳健的校准评分用于DNA甲基化类别分配。成功的整合诊断还依赖于分类器前的H&E诊断，使用海德堡脑肿瘤分类器，96.2%的H&E恶性弥漫性胶质瘤、91.5%的H&E弥漫性胶质瘤但仅60%的H&E局限性胶质瘤可分类。当使用替代分类器EpiDiP和贝塞斯达时，较高的DNA输入量改善了分类稳健性。尽管如此，中线位置的高级别胶质瘤和低级别胶质/胶质神经元肿瘤的诊断仍构成挑战。本研究结果证明了DNA甲基化谱分析和分子分级在小型脑肿瘤标本中的广泛适用性，但需注意某些肿瘤和位置可能受益于额外的分子和计算方法以增加未来与分类相关的甲基化信号。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
中枢神经系统肿瘤影响各年龄段患者，其预后主要由肿瘤类型、WHO分级及位置决定。对于位于深部或广泛浸润性生长的肿瘤，立体定向活检（STX）是获取组织样本的首选方法，但STX样本通常仅有数毫米大小，限制了分析技术的应用范围。基于DNA甲基化的脑肿瘤分类为组织学和遗传学增加了独立的诊断维度，但现有研究对低DNA输入量及小样本对分类器评分和拷贝数谱的影响尚不明确。WHO分类未严格规定分子检测所需的最佳样本大小、肿瘤细胞比例或DNA浓度，而试剂供应商的建议（如阵列分析需250ng DNA）对STX样本常难以满足。因此，有必要系统评估STX样本在基于DNA甲基化的神经病理诊断中的适用性，并明确DNA浓度和肿瘤细胞含量的最低阈值。
**研究内容与结论**
研究人员回顾性分析了2017年至2020年间在法兰克福大学医院神经外科和神经研究所接受STX的237例脑肿瘤患者标本。所有样本经福尔马林固定石蜡包埋（FFPE），平均体积1 mm3，进行DNA甲基化分析（人类甲基化EPIC阵列v1）、拷贝数谱分析、肿瘤去卷积（MethylCIBERSORT和LUMP算法），并应用海德堡（v11b4）、贝塞斯达（v2）和EpiDiP三种脑肿瘤分类器。研究得出以下主要结论：
1. **高诊断可行性**：90.5%的样本可分配DNA甲基化类别，61.6%达到海德堡分类器评分>0.84；96.9%的样本可检测到指示性拷贝数变异（CNV）。
2. **最低输入阈值**：通过递归划分模型，DNA浓度≥1.21 ng/μl（约54.5 ng绝对DNA）时，获得海德堡评分>0.84的概率从0.31提升至0.71；肿瘤细胞比例≥53%时，概率从0.43提升至0.76。
3. **整合诊断依赖预分类诊断**：H&E恶性弥漫性胶质瘤、弥漫性胶质瘤和局限性胶质瘤分别有96.2%、91.5%和60%可实现整合诊断，而中线高级别胶质瘤和低级别胶质/胶质神经元肿瘤仍具挑战。
4. **替代分类器作用**：对海德堡分类器未分类的“NOS”样本，EpiDiP和贝塞斯达分类器可提供额外诊断线索，但较低DNA输入量时分类稳健性下降。
5. **拷贝数谱的关键作用**：在无明确分类器评分时，CNV（如EGFR扩增、7号染色体增益/10号染色体丢失）为整合诊断提供了关键依据。
**意义**
该研究证实STX样本在低于当前推荐DNA输入量下仍可支持基于DNA甲基化的分子分级，为临床实践中有限样本的精准诊断提供了重要依据，并提示需结合肿瘤位置和亚型采用补充方法（如计算信号净化）。论文发表于《Acta Neuropathologica Communications》。
**关键技术方法**
1. **DNA甲基化谱分析**：使用Human Methylation EPIC array v1对FFPE样本进行全基因组甲基化检测。
2. **脑肿瘤分类器**：应用海德堡（v11b4）、贝塞斯达（v2）和EpiDiP三种分类器获取校准评分及甲基化类别分配。
3. **拷贝数谱分析**：基于海德堡分类器输出检测染色体和基因位点水平的拷贝数变异（CNV）。
4. **肿瘤去卷积**：通过MethylCIBERSORT（参考甲基组比较）和LUMP算法（白细胞去甲基化评估）估算肿瘤细胞、免疫细胞及胶质细胞比例。
5. **递归划分与重采样验证**：结合重复随机子采样的稳定性分析，确定DNA浓度和肿瘤细胞比例的最低阈值。
**研究结果**
**1. 研究流程与患者特征**
共237例患者，中位年龄59岁，男性占60.3%，94.9%为新发颅内占位。基于常规诊断工作流程（RDW），胶质瘤占227例（95.8%），其中恶性弥漫性胶质瘤131例、弥漫性胶质瘤86例、局限性胶质瘤10例。
**2. 样本特征与质量控制**
中位DNA浓度6.26 ng/μl，40.9%的样本DNA量<250 ng。通过RnBeads质量检查的样本为232/237（97.9%），5例因低质量被剔除。
**3. 海德堡分类器结果**
90.5%的样本可分配甲基化类别，56%评分>0.9。75%的样本校准评分与组织学诊断一致，10.7%存在不一致（4%升级、6.7%降级）。MGMT启动子甲基化状态在91.9%的样本中可评估，且与DNA输入量显著相关（p=0.0008）。
**4. 拷贝数谱分析**
96.9%的样本显示CNV，其中H&E恶性弥漫性胶质瘤、弥漫性胶质瘤、局限性胶质瘤的CNV检出率分别为99.2%、96%、80%。在DNA不可测量组中，CNV检出率为100%。
**5. 整合诊断**
在131例恶性弥漫性胶质瘤中，87%被分配至“胶质母细胞瘤，IDH野生型”甲基化类别，91.6%诊断为CNS WHO 4级。在82例弥漫性胶质瘤（无恶性征象）中，32.9%最终诊断为胶质母细胞瘤，IDH野生型，WHO 4级；14.6%为弥漫性中线胶质瘤，H3K27改变。局限性胶质瘤中60%为毛细胞星形细胞瘤。
**6. 替代分类器分析**
对海德堡分类器未分类的16例NOS样本，EpiDiP将“高级别胶质瘤，NOS”全部邻接至胶质母细胞瘤，IDH野生型亚类；而贝塞斯达分类器将其分配至“胶质母细胞瘤”、“中间级别IDH野生型胶质瘤”等。低级别NOS样本在EpiDiP和贝塞斯达分类器间存在显著差异，表明分类复杂性。
**7. 肿瘤去卷积与递归划分**
肿瘤细胞比例在DNA输入>250ng组显著高于>0-250ng组，而胶质细胞比例在不可测量组最高。递归划分显示，海德堡分类器评分>0.84所需DNA浓度阈值为1.21 ng/μl，肿瘤细胞比例阈值为53%；评分>0.9所需阈值分别为3.18 ng/μl和62%。贝塞斯达分类器则需DNA浓度≥2.95 ng/μl或肿瘤细胞比例≥37.4%以达到家族评分>0.9。
**讨论与结论**
本研究表明，STX来源的小样本（平均1 mm3）在大多数情况下足以进行基于DNA甲基化的分子分类和拷贝数分析，但诊断成功率依赖于肿瘤类型和位置。H&E局限性胶质瘤和中线高级别胶质瘤是主要挑战，提示可能需要额外分子检测（如二代测序）或计算信号净化方法。研究提出的最低输入阈值（DNA浓度1.21 ng/μl，肿瘤细胞比例53%）为探索性结果，需在外部队列中验证。总体而言，STX样本可满足现代神经病理诊断标准，但临床实施前需前瞻性多中心验证。
