《Journal of Biomedical Science》：Hidden asymptomatic breakthrough infection in a proof-of-concept longitudinal study on SARS-CoV-2 vaccine recipients
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背景：具有无症状SARS-CoV-2感染的个体可能不知不觉地传播病毒，然而在接种疫苗后的人群中识别此类亚临床感染仍然具有挑战性。方法：研究人员对129名未感染过SARS-CoV-2的疫苗受试者进行了一项纵向研究，这些受试者接种了不同组合的SARS-CoV-2刺
背景：具有无症状SARS-CoV-2感染的个体可能不知不觉地传播病毒，然而在接种疫苗后的人群中识别此类亚临床感染仍然具有挑战性。方法：研究人员对129名未感染过SARS-CoV-2的疫苗受试者进行了一项纵向研究，这些受试者接种了不同组合的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）疫苗平台。在第一次接种前（v1）、第三次接种后2周（v7）和6个月（v8）收集血清样本。台湾首次大规模COVID-19疫情发生在v7和v8之间。研究人员通过ELISA测量了抗核衣壳（anti-N）和抗S免疫球蛋白G（IgG）抗体滴度，并使用活病毒和假病毒测定评估了病毒中和活性。结果：通过开发一种迭代系列筛选方法，研究人员在未确诊病例中识别出无症状突破性（接种后）感染。v7-v8配对队列分为三个不同的组：确诊病例（21%）、无症状突破性感染（17%）和未感染受试者（62%）。在标准化后的v8血清中，确诊病例表现出抗S+++（高）/抗N+++（高）表型，而未感染受试者表现出抗S+（低）/抗N+（基线）表型。统计分析验证了一个独特的无症状组，其特征为抗体谱抗S++（中等）/抗N+（基线）。结论：这种方法可能能够更准确地估计疫苗效力和感染流行率。在刺突蛋白疫苗接种人群中，抗N抗体更像是COVID-19症状性疾病的潜在特异性标志物，而不是SARS-CoV-2感染的理想标志物。据研究人员所知，这是首次使用自身匹配的纵向配对血清样本从良好疫苗接种人群中识别无症状突破性感染的初步报告。
**研究背景与问题**
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）自2019年12月成为全球病原体，尽管疫苗和抗病毒药物已投入使用，但控制2019冠状病毒病（COVID-19）仍面临诸多挑战，包括疫苗犹豫、长新冠、突破性感染及免疫逃逸变异株的出现。隔离感染者是控制疫情的关键措施，但无症状（亚临床）感染者是病原体传播的重要来源。在疫苗商业化前，未接种人群中可通过循环抗刺突蛋白（anti-S）抗体识别无症状感染。然而，当前高疫苗覆盖率地区，所有接种后免疫功能健全的个体均预期为抗S阳性，无论其感染或症状状态如何。抗核衣壳（anti-N）抗体虽为病毒感染的另一标志物，但在未接种人群的无症状感染中常检测不到（即缺乏有效的抗N血清转换）。在接种人群中，尽管症状性突破性感染中可检测到抗N抗体，但抗N抗体单独或与抗S抗体联合能否作为无症状突破性感染的血清学标志物尚不明确。因此，识别良好疫苗接种人群中的无症状突破性感染是领域内的重要问题，准确诊断对流行病学实践、更精确地估计感染率、疫苗效力和群体免疫至关重要。
**研究内容与结论**
研究人员开展了一项纳入了129名未感染过SARS-CoV-2的疫苗受试者的纵向研究，这些受试者接种了不同组合的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）疫苗平台。在第一次接种前（v1）、第三次接种后2周（v7）和6个月（v8）收集血清。台湾首次大规模Omicron BA.4/BA.5疫情爆发恰发生在v7与v8之间。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量抗N和抗S IgG抗体滴度，并采用活病毒中和试验（使用原型株CDC4和D614G变异株KMU-1）及假病毒中和试验（B.1.1.7变异株）评估病毒中和活性。研究人员开发了一种迭代三步系列筛选方法，利用自身匹配的纵向配对血清样本，从未确诊病例中成功识别出无症状突破性感染。该研究揭示了三种截然不同的感染状态组：确诊病例（21%）、无症状突破性感染（17%）和未感染受试者（62%）。无症状突破性感染的特征性血清学表型为抗S中等水平（anti-S++）和抗N基线水平（anti-N+），与确诊病例的anti-S+++/anti-N+++表型及未感染者的anti-S+/anti-N+表型显著区分。该研究证明，在刺突蛋白疫苗接种人群中，抗N抗体水平高于疫苗接种前基线仅反映近期症状性疾病，而非所有近期感染；血清抗N抗体未高于基线仅反映近期无症状和疾病，并不必然反映近期无病毒感染。这是首次使用从良好疫苗接种人群中纵向收集的自身配对血清样本成功识别无症状突破性感染的初步报告，相关成果发表于《Journal of Biomedical Science》。
**主要关键技术方法**
本研究采用纵向自身配对设计，样本队列来源于台湾高雄医学大学医院（KMUH），共129名未感染过SARS-CoV-2的成年疫苗受试者，涵盖不同性别、年龄和合并症。关键技术包括：利用ELISA定量检测抗核衣壳（anti-N）和抗刺突蛋白受体结合域（anti-S-RBD）IgG抗体滴度；使用活病毒中和试验（以CDC4原型株和D614G变异株KMU-1感染表达人ACE2-TMPRSS2的Vero E6细胞）及假病毒中和试验（B.1.1.7变异株假病毒感染表达人ACE2的HEK293细胞）评估病毒中和活性。研究核心在于开发了一种迭代三步系列筛选方法，以自身匹配的v7-v8血清对为基础，结合v4-v3时间点的抗体衰减动力学比较，通过设置不同阈值（以确诊病例为参考），逐步筛选出候选无症状突破性感染个体。
**研究结果**
**Study design**：研究设计概述了疫苗接种时间线（AZ/AZ/MO、AZ/MO/MO、MO/MO/MO等方案）及血清采集时间点（v1、v3、v4、v7、v8），并指出台湾疫情爆发发生在v7和v8之间，为识别无症状感染提供了自然实验条件。
**Differential anti-S antibody dynamics**：通过比较v7和v8的抗S抗体滴度，研究人员发现大多数血清呈下降趋势（负斜率），但部分确诊病例（11/11）和少数非确诊病例（如A3、M31）呈现上升趋势（正斜率），提示可能存在非确诊病例中的无症状突破性感染。
**Asymptomatic breakthrough infection in non-confirmed cases?**：绘制v7 vs v8抗S抗体散点图，非确诊病例中部分样本（橙色圆点）的v8抗体滴度等于或高于v7（v8≥v7），这与无感染状态下抗体自然衰减的预期（v7>v8）不符，提示这些样本可能为无症状突破性感染。
**Confirmed cases exhibited a nearly 100-fold higher level of anti-N IgG**：检测v8血清中抗N抗体，确诊病例（排除异常值A25）的抗N抗体水平是非确诊病例的约81倍，差异高度显著（p<0.001）。而部分非确诊病例（如橙色圆点样本）虽保持抗S抗体不降，但抗N抗体仍为基线水平，进一步支持其为无症状感染。
**Primary screening for candidate asymptomatic breakthrough infection from non-confirmed cases**：设计三步迭代筛选方法，以确诊案例A82的最低v8/v7比值（0.49）为第一筛选阈值，从非确诊病例中初步筛选出5个候选样本（A3、A48、A91、M12、M31），其v8/v7比值高于该阈值。
**Secondary screening for more asymptomatic breakthrough infection via a secondary cutoff**：引入log?{(v8/v7)/(v4/v3)}作为第二筛选指标，以确诊案例A24的最低值为参考，识别出额外候选A31；第三筛选以比值=1为阈值，进一步识别出A42。最终通过假病毒和活病毒多重试验验证，汇总10个候选无症状突破性感染（A2、A3、A31、A42、A48、A91、M12、M31、M15、M22）。
**Reproducibility by multiple assays and ROC analysis**：通过假病毒和活病毒中和试验重复筛选，并进行受试者工作特征（ROC）曲线分析。抗S抗体的v8/v7比值在ELISA（AUC=0.99）和假病毒试验（AUC=0.98）中均表现出极佳的无症状突破性感染与未感染区分能力，而抗N抗体的v8/v1比值区分能力差（AUC=0.45），证实抗N抗体不能作为无症状感染的标志物。
**Comparisons of antibody kinetics between different infection status groups in different assays**：比较三组抗S抗体v8/v7比值，无症状组和确诊病例组显著高于未感染组（p<0.001，所有四种试验）。在假病毒和CDC4活病毒试验中，确诊病例与无症状组之间也存在显著差异（p<0.01和p<0.05），表明无症状组呈现中等水平的抗S抗体增强（约5倍于未感染组），而确诊病例增强约10-20倍。
**Percentages of different infection status groups in total participant populations**：在61名参与者（含未配对样本）中，无症状突破性感染占17%，确诊病例21%，未感染62%，总感染率约38%。三组在年龄、性别、合并症或疫苗方案上无显著相关（Fisher确切检验，p=0.62）。
**总结与结论**
讨论部分：研究人员探讨了抗S++/抗N+表型的可能机制，包括：额外疫苗剂量可能性极低；通过二次筛选（{(v8/v7)/(v4/v3)}≥1）排除了单纯抗体衰减慢的情况；抗N抗体衰减更快但不足以解释该现象；ELISA灵敏度限制；S蛋白免疫原性更强；无症状感染可能为短暂或顿挫性感染，不足以激发抗N体液免疫反应。与荷兰一项横断面研究比较，本研究的纵向自身配对设计可消除个体间差异，从而更灵敏地检测无症状感染。该研究还提出，疫苗效力可通过无症状突破性感染与确诊病例的比例（17%/21%）来评估，更高的比例提示更好的保护效果。局限性包括样本量较小，未来需独立验证队列支持。
结论部分翻译：研究人员在此描述了一种血清学特征，即抗S++（中等）/抗N+（基线），这是良好疫苗接种人群中无症状突破性感染的特征。这种血清学表型与确诊病例（抗S+++（高）/抗N+++（高））和未感染受试者（抗S+（低）/抗N+（基线））截然不同。在刺突蛋白疫苗接种人群中，血清抗N抗体高于疫苗接种前基线水平反映了近期的症状和疾病。另一方面，血清抗N抗体未高于基线水平反映了近期没有症状和疾病，但未必反映近期没有病毒感染。据研究人员所知，这是首次使用从良好疫苗接种人群中纵向收集的自身配对血清样本成功识别无症状突破性感染的初步报告。
