整合代谢组学-去重复化策略引导分离新的聚酮化合物(?)-R-talaropinophiloic acid

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Isolation of the new polyketide (?)-R-talaropinophiloic acid guided by an integrated metabolomics-dereplication approach

　　

作为研究人员持续针对内生真菌的生物勘探计划的一部分，从Euphorbia umbellata中分离出菌株Talaromyces pinophilus J6。通过基于Talaromyces代谢物内部高分辨率质谱（HRMS）数据库的联合代谢组学-去重复化工作流程，评估了该内生菌的代谢潜力。该策略能够快速注释七种代谢物（a-g），从而快速表征真菌代谢组，并指导分离潜在的新特化代谢物。将T. pinophilus J6在补充有硫酸铵的马铃薯葡萄糖琼脂上培养后的粗提物进行色谱分离，得到两种聚酮化合物：新的(?)-R-talaropinophiloic acid (1)和已知的3-O-methylfunicone (2)。其化学结构通过核磁共振（NMR）、圆二色谱（CD）和HRMS分析确定。通过MTT法评估了针对肌层浸润性膀胱癌细胞系T24的细胞毒性活性，得到化合物1的IC₅₀为204.70 μM，化合物2的IC₅₀为59.68 μM，而阳性对照顺铂为6.4 μM。针对非肿瘤RPE-1细胞系的检测显示，化合物2的CC₅₀为16.62 μM，而化合物1无毒性，突显了化合物1对癌细胞的高度选择性。总体而言，研究人员的结果扩展了对Talaromyces属化学多样性的认识，并强调了其作为新型生物活性聚酮化合物有前景来源的潜力。

大戟属（Euphorbia）植物具有民族药理学相关的细胞毒性活性，其内生菌被认为是结构多样且生物活性代谢物的有前景来源。然而，针对大戟属相关微生物的研究仍较匮乏。内生真菌在竞争性自然环境中产生特化代谢物，但常规实验室培养条件下，许多生物合成基因簇因缺乏特定环境信号而转录沉默，限制了天然产物库的挖掘。OSMAC（一菌多化合物）策略通过系统改变培养参数可诱导沉默途径，但理性选择最佳条件仍是挑战，传统方法难以全面鉴定代谢物。因此，现代天然产物分析策略（如去重复化和非靶向代谢组学）对于快速优先发现新化合物至关重要。本研究旨在探索从Euphorbia umbellata叶片中分离的内生真菌Talaromyces pinophilus J6的代谢潜力，通过代谢组学-去重复化工作流程，在添加硫酸铵的PDA培养基上培养，分离两种聚酮化合物，并评估其对膀胱癌细胞的细胞毒性活性。该研究扩展了Talaromyces属的化学多样性，并强调了其作为新型生物活性聚酮化合物来源的潜力。论文发表在《World Journal of Microbiology and Biotechnology》。

研究人员开展研究的主要关键技术方法包括：基于超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC/ESI Q-Orbitrap HRMS）的非靶向代谢组学分析，结合内部Talaromyces代谢物数据库（773个化合物）进行去重复化注释；采用主成分分析（PCA）进行无监督多元统计，以区分不同培养条件下的代谢谱差异；通过核磁共振（NMR）波谱、圆二色谱（ECD）结合含时密度泛函理论（TD-DFT）计算确定新化合物的绝对构型；采用MTT法评估化合物对膀胱癌细胞系T24和正常细胞系RPE-1的细胞毒性。样本来源为从Euphorbia umbellata叶片中分离的内生真菌Talaromyces pinophilus J6。

研究结果部分：

**非靶向代谢组学揭示内生真菌间的代谢差异**：对六株内生菌（J1, J5, J6, J7, J9, J13）在三种培养基（PDA、PDA补充酒石酸钠二水合物PDA_ST、PDA补充硫酸铵PDA_AS）上的粗提物进行UHPLC-HRMS分析，结合PCA显示，菌株J6在PDA_AS条件下的代谢谱与其他样品显著分离，表明其独特的代谢物谱，因此优先选择J6在PDA_AS条件下进行后续化学研究。

**内生真菌J6的分子鉴定及其提取物的化学去重复化**：通过β-微管蛋白（benA）基因序列的系统发育分析，将J6鉴定为Talaromyces pinophilus，与T. pinophilus CBS 631.66形成高支持度分支（bootstrap值99%）。去重复化工作流程注释了94种仅在PDA_AS培养基中产生的特化代谢物，其中7种化合物（a-g）基于MS1和MS2数据被优先注释：3,4-二羟基苯乙酸甲酯（a）、3-(羟甲基)-6,8-二甲氧基-2H-色烯-2-酮（b）、talaromycolide A（c）、actofunicone（d）、amestolkin A（e）、funicone（f）和rubralide C（g）。这些化合物主要属于香豆素、苯酞和funicone相关类别，此前在其他Talaromyces菌株中有报道。

**T. pinophilus J6主要特化代谢物的分离与鉴定**：大规模培养J6在PDA_AS培养基上，经色谱纯化得到两种聚酮化合物：新化合物(?)-R-talaropinophiloic acid (1)和已知化合物3-O-methylfunicone (2)。通过NMR和HRESIMS数据解析了1的结构，其分子式为C₁₉H₁₆O₇，具有一个不对称中心（C-3），并带有甲基和羧基取代。ECD实验与计算光谱对比确定其绝对构型为3R，因此命名为(?)-R-talaropinophiloic acid。化合物2通过NMR鉴定为3-O-methylfunicone，其结构为γ-吡喃酮通过酮桥连接α-间苯二酸单元。

**细胞毒性活性**：通过MTT法评估化合物对膀胱癌细胞系T24和正常细胞系RPE-1的细胞毒性。化合物1对T24细胞的IC₅₀为204.70 μM，显示弱细胞毒性，但在测试浓度范围内对RPE-1细胞无显著毒性，表明其高度选择性。化合物2对T24细胞的IC₅₀为59.68 μM，但同时对RPE-1细胞的CC₅₀为16.62 μM，选择性指数（SI）为0.27，表明其细胞毒性较强但选择性差。

讨论部分总结：代谢组学辅助工作流程有效加速了真菌特化代谢物的初步鉴定，改变培养条件增强了隐蔽代谢物的产生，并导致新天然产物的发现。两种聚酮化合物在膀胱癌细胞中表现出不同的细胞毒性特征：化合物1活性弱但选择性高，化合物2活性强但选择性低。化合物1作为新化学型，具有良好的选择性，为未来衍生物设计和先导优化提供了有前景的候选分子。此前研究显示3-O-methylfunicone通过多种机制抑制肿瘤细胞，包括下调survivin表达、端粒酶活性、调节细胞周期等。本研究表明，优化培养条件结合内部数据库去重复化是发现新天然产物的成功策略。

研究结论翻译：总之，对真菌菌株T. pinophilus J6发酵产物的化学研究实现了对其粗提物的全面表征，注释了七种代谢物（a-g），并指导分离出两种聚酮化合物：新的(?)-R-talaropinophiloic acid (1)和已知化合物3-O-methylfunicone (2)。结果突显了代谢组学辅助工作流程在加速真菌特化代谢物初步鉴定方面的有效性。此外，在改良条件下培养T. pinophilus J6增强了隐蔽代谢物的产生，并导致具有相关生物活性的新天然产物的发现。两种分离的聚酮化合物在膀胱癌细胞中表现出不同的细胞毒性特征：化合物1表现出弱细胞毒性活性，但对肿瘤细胞具有良好选择性，而化合物2表现出更高效力，但由于其对正常细胞的显著毒性，选择性降低。这是首次描述从E. umbellata中分离的内生真菌T. pinophilus J6的代谢组学研究的报道，进一步证实了与药用植物相关的内生真菌作为化学多样且生物相关天然产物来源的潜力。改变真菌生长条件与使用内部数据库去重复化的整合，被证明是发现新天然产物的成功方法。尽管如此，需要进一步的机制、生物合成和体内研究来充分阐明所分离化合物的生物潜力。