解析177Lu基放射性配体疗法的表型应答以鉴定有效联合用药方案

《European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging》：Deciphering the phenotypic responses to 177Lu-based radioligand therapy to identify efficacious combinations

　　

目的：放射性配体疗法（RLT）将镥-177（177Lu）等放射性核素递送至癌细胞以实现选择性靶向。尽管177Lu基RLT临床结局良好，但完全治愈仍罕见。全面理解其作用模式（MoA）对于策略性设计可改善治疗应答的新型联合方案至关重要。方法：研究人员通过免疫荧光在177Lu-DOTA处理的癌细胞系中分析DNA损伤应答（DDR）标志物；利用多种DDR缺陷同基因细胞系和DDR抑制剂在存活实验中筛选177Lu-DOTA的增敏剂；进一步在体外与体内表征177Lu-RLT与非同源末端连接（NHEJ）核心因子DNA-PK抑制剂的联合对存活和细胞死亡的影响。结果：177Lu-DOTA处理诱导了指示DNA双链断裂（DSB）修复与基因组不稳定的多种DDR生物标志物。同基因模型与抑制剂存活实验表明，NHEJ通路缺失对177Lu-DOTA增敏最强。一致地，DNA-PK抑制强烈增敏PSMA阳性前列腺癌细胞对177Lu-PSMA-617的应答，加剧凋亡与细胞周期阻滞，并在体内改善疗效且耐受性良好。结论：结果揭示了177Lu基RLT的新机制见解，明确NHEJ是修复177Lu诱导DNA损伤的关键通路。DNA-PK抑制较其他受检DDR抑制剂组合增敏更强，值得临床探索177Lu基RLT与DNA-PK抑制剂（DNA-PKi）联合。

研究背景与立项依据

放射性配体疗法（RLT）利用偶联放射性核素的分子靶向肿瘤特异性表面受体，其中¹⁷⁷Lu标记的DOTATATE与PSMA-617已获批用于生长抑素受体2阳性神经内分泌肿瘤与PSMA阳性转移性去势抵抗前列腺癌（mCRPC），显著改善总生存与无进展生存，但治愈率低。电离辐射最主要细胞毒效应为DNA损伤，因此联合DNA损伤应答（DDR）抑制剂是改善疗效的重要方向。已有研究提示PARP抑制剂可增敏部分模型，但反应不一；而全基因组CRISPR筛选指向NHEJ核心因子DNA-PKcs是¹⁷⁷Lu-DOTA-octreotate的强增敏靶点，且既往研究在神经内分泌肿瘤与前列腺、肾模型证实了DNA-PK抑制的增敏作用。然而¹⁷⁷Lu基RLT在前列腺癌细胞中诱导的表型应答、相关DNA损伤及修复通路图谱仍不清楚。该研究即在前列腺癌症模型中系统刻画¹⁷⁷Lu基RLT的表型应答，比较¹⁷⁷Lu与X射线诱导的DDR标志物，并通过遗传与药理阻断DNA修复通路以鉴定高效联合策略。论文发表于《European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging》。

主要关键技术方法

研究人员采用三种癌细胞系（DLD-1、LNCaP clone FGC、DU145 PSMA High及PC-3 MP9等PSMA工程模型）开展体外实验；使用无载体添加¹⁷⁷Lu标记DOTA或PSMA-617（标记后比活度60 MBq/nmol用于体外、100 MBq/nmol用于体内），以X射线（CellRad柜，1.02 Gy/min）作对照辐射；通过免疫荧光高通量定量γH2AX、53BP1、RAD51、XRCC1、磷酸化ATM（pATM）焦点及微核；利用17种DDR通路关键因子缺陷同基因模型（涵盖NHEJ、同源重组HR、Fanconi贫血FA、G2/M检查点、BER、NER、MMR）与包括DNA-PKi（AZD7648）、ATMi、四种PARPi在内的临床相关DDR抑制剂进行存活实验计算增敏倍数（PF）；借助Incucyte活细胞成像定量凋亡（Caspase-3/7）与细胞死亡；以EdU/DAPI染色做细胞周期分型；体内采用雌性裸鼠（Crl:NU-Foxn1^nu）皮下接种PC-3 MP9来源异种移植瘤，评估AZD7648口服联合单剂¹⁷⁷Lu-PSMA-617静脉给药的瘤体生长、生存、体重及外植肿瘤γH2AX免疫荧光。

研究结果

profiling DDR marker induction by [¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA

研究人员以持续存在的¹⁷⁷Lu-DOTA处理DLD-1、LNCaP与DU145 PSMA High，免疫荧光显示其诱导γH2AX、53BP1、RAD51、pATM、XRCC1焦点及微核积累，动力学较X射线EBRT更迟缓持久；表明¹⁷⁷Lu同时引发单链断裂（SSB，XRCC1）与双链断裂（DSB，γH2AX），激活pATM检查点，并启动NHEJ（53BP1）与HR（RAD51）两条DSB修复通路，未修复损伤表现为微核。

Sensitisation to [¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA by loss or inhibition of DDR pathways

在17个DDR缺陷同基因模型中，NHEJ核心因子PRKDC（DNA-PKcs）与NHEJ1缺失增敏最强，HR、ATM、FA缺陷次之；药理抑制中DNA-PKi在全部细胞系一致增敏，ATMi仅DLD-1较强，四种PARPi（olaparib、veliparib、talazoparib、AZD5305）均无增敏。结论：¹⁷⁷Lu致死的DNA损伤以NHEJ修复的DSB为主，阻断NHEJ（DNA-PK）或DSB信号（ATM）可强增敏。

Phenotypic responses and combination potential of [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA-617 in prostate cancer cell lines

在LNCaP、DU145 PSMA High、PC-3 MP9中确认PSMA表达与¹⁷⁷Lu-PSMA-617摄取一致；该药呈剂量依赖诱导γH2AX、53BP1、pATM、RAD51与微核，24小时后洗脱则96小时标志物回落（微核除外）。活细胞成像显示 confluence下降伴Caspase-3/7与细胞毒升高。DNA-PKi与ATMi均可增敏，DNA-PKi增敏最稳定。

Characterisation of DNA-PK inhibitor and [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA-617 combination in prostate cancer models

联合AZD7648后，¹⁷⁷Lu-PSMA-617诱导的γH2AX、53BP1、pATM、RAD51焦点与微核在24及96小时均进一步累积且无法回落；凋亡、细胞死亡显著增强，DU145长期（3周）生长完全抑制；细胞周期G2/M阻滞被联合加重。结论：NHEJ失效使¹⁷⁷Lu相关DSB不可修复，阻滞有丝分裂并致死。

DNA-PK inhibitor combination with [¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA-617 in vivo

PC-3 MP9裸鼠异种移植中，AZD7648不改变¹⁷⁷Lu-PSMA-617瘤内摄取值（4小时约9% ID/g，24小时约6% ID/g）与外周清除。单剂DNA-PKi或RLT均抑瘤有限，联合组肿瘤生长显著受抑，中位生存由载体组26.5天、单剂30与33天提升至>37天，体重无显著下降；外植瘤120小时γH2AX焦点高于单剂RLT。体内证实联合高效且耐受。

讨论与结论翻译

讨论指出β^?发射体¹⁷⁷Lu经直接粒子作用或ROS间接致DNA损伤，SSB曾引出PARP抑制剂增敏假说，但该文与部分既往研究均显示PARPi在前列腺模型中增敏不稳定，而NHEJ缺失在γ射线全基因组筛选与¹⁷⁷Lu-DOTA-octreotate筛选中均为最强命中，与该文一致。DNA-PK作为NHEJ核心PIKK家族因子，其抑制阻断DSB直接连接，使¹⁷⁷Lu诱导DSB累积、G2/M阻滞与有丝分裂灾难。ATM虽参与DSB感知并调控NHEJ/HR，但增敏弱于DNA-PKi。研究局限包括未做吸收剂量匹配、异种移植无法评估免疫与正常组织放射增敏。

结论原文浓缩翻译：上述结果提供¹⁷⁷Lu基RLT新机制见解，明确NHEJ是修复¹⁷⁷Lu诱导DNA损伤的关键通路；DNA-PK抑制较其他受检DDR抑制剂组合更强增敏癌细胞对¹⁷⁷Lu基RLT的应答，值得推进¹⁷⁷Lu基RLT与DNA-PKi的临床联合探索。