具有内源性荧光的新型EGFR酪氨酸激酶抑制剂

《Investigational New Drugs》：Novel EGFR tyrosine kinase inhibitors exhibiting intrinsic fluorescence

　　

激酶抑制剂（kinase inhibitors）常用于研究和临床实践。其中，不可逆表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如阿法替尼（afatinib）和奥希替尼（osimertinib），构成一个重要亚类。本研究旨在创建一种具有内源性荧光（即无需额外荧光团的内在荧光）的不可逆共价EGFR TKI。这些化合物，命名为SQI-2、SLT40和SLT41，被成功开发，并显示出有效抑制EGFR、EGFRL858R/T790M和EGFRvIII激酶。所开发的化合物适用于一系列细胞化学分析，包括实时检测。提出的TKIs可作为研究和诊断工具，并代表新型治疗化合物的前体。

**论文解读：具有内源性荧光的新型EGFR酪氨酸激酶抑制剂的开发与应用**

**研究背景与问题**

ErbB蛋白家族（尤其是表皮生长因子受体（EGFR））在多种癌症中发生突变，如EGFRvIII（缺失外显子2-7的组成型活性突变体）和EGFRL858R/T790M（双重突变体），这些突变体对配体诱导的降解具有抵抗性，并促进细胞增殖和抑制程序性细胞死亡。现有酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已发展至第三代，但缺乏同时具备共价结合能力和内源性荧光（即无需额外荧光团即可发出荧光）的分子工具。研究人员旨在开发一种不可逆的共价EGFR TKI，其本身具有荧光，可用于实时细胞化学分析、诊断研究，并可能作为光动力治疗的前体。该研究发表在《Investigational New Drugs》上。

**研究内容与结论**

研究人员成功设计并合成了三种化合物：SQI-2（(2E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[(E)-2-[4-(二甲氨基)苯基]乙烯基]喹唑啉-6-基}-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺）、SLT40（N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-{2-[4-(二甲氨基)苯基]乙炔基}喹唑啉-6-基}丙-2-烯酰胺）和SLT41（N-{4-[(3-氯苯基)氨基]-7-{2-[4-(二甲氨基)苯基]乙炔基}喹唑啉-6-基}丙-2-烯酰胺）。这些化合物基于4-氨基喹唑啉骨架（EGFR/ErbB药效团），并引入苯乙烯基或芳基乙炔基荧光臂，利用扭曲分子内电荷转移（TICT）激发态实现环境敏感荧光。分子对接研究显示，它们以类似阿法替尼（afatinib）的（S）-构型与EGFR激酶结构域Cys797共价结合。体外实验表明，SQI-2、SLT40和SLT41能有效抑制EGFR、EGFRvIII和EGFRL858R/T790M的激酶活性，并导致受体蛋白积累。完整蛋白质液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析证实，这些化合物与EGFR形成稳定加合物，质量偏移与预期一致。荧光显微镜观察显示，SQI-2和SLT40在与EGFR结合后发出荧光，信号强度与EGFR表达水平相关，且可用于实时检测。SLT41因荧光信号弱且背景高，不适用于成像。这些化合物作为研究和诊断工具具有潜力，但需进一步优化以克服非特异性结合和荧光干扰。

**主要技术方法**

研究人员采用分子对接（AutoDockFR共价对接协议，以Cys797为反应残基，使用EGFR激酶结构域晶体结构PDB ID: 4G5J和4I22）指导化合物设计。完整蛋白质LC-HRMS分析（ZenoTOF 7600质谱仪，电喷雾电离正离子模式）用于检测EGFR-配体加合物形成。细胞实验使用细胞系：DK-MG（DSMZ，含EGFRvIII高表达亚系）、H1975（ATCC，表达EGFRwt和EGFRL858R/T790M）、AD293（Agilent Technologies，低EGFR表达）和GL261（DSMZ，中等EGFR表达）。Western blot（变性/半天然/天然电泳）分析总蛋白和磷酸化蛋白水平及二聚化。细胞化学和免疫细胞化学染色（Nikon Eclipse Ci-S荧光显微镜）评估化合物与EGFR的结合及荧光性能。实时细胞观察（Juli?FL NanoEnTek）监测SQI-2的长时间荧光。

**研究结果**

**Design**：基于4-氨基喹唑啉骨架，引入苯乙烯基（SQI-2）或芳基乙炔基（SLT40、SLT41）荧光臂，利用TICT机制实现环境敏感荧光，荧光激发波长460-500 nm，发射波长510-560 nm。

**Docking studies**：分子对接显示，SQI-2、SLT40和SLT41在EGFR激酶活性与非活性构象中均以类似阿法替尼的（S）-构型与Cys797共价结合，形成氢键（Met793）和卤键（Leu788）。

**SQI-2, SLT40, and SLT41 are blockers of the EGFR tyrosine kinase and its mutated forms**：Western blot实验表明，在DK-MGhigh细胞（高表达EGFRvIII）中，SQI-2降低磷酸化EGFR（Tyr1045）水平，但不影响总蛋白。SLT40和SLT41在DK-MGextra?high和AD293wt细胞中抑制EGFRvIII和EGFRwt的磷酸化（Tyr1173），并呈浓度依赖性地增加总蛋白水平。半天然Western blot显示，SLT40和SLT41阻断EGFRvIII二聚体与单体的磷酸化，并增加二聚体数量。天然电泳证实，SLT40和SLT41的荧光信号与抗EGFR A-10抗体信号共定位，表明稳定结合。

**SQI-2 and SLT40 exhibit fluorescence after binding to EGFR**：在GL261（低至中等EGFR表达）细胞中，SQI-2（25 μM）结合后显示明显荧光，与抗EGFR抗体信号重合。在AD293（极低EGFR）细胞中仅见微弱信号，而在H1975和DK-MGhigh细胞中信号强。EGF诱导的降解在H1975细胞中降低SQI-2信号，但在DK-MGhigh（EGFRvIII无EGF结合域）中无影响。实时观察显示SQI-2荧光持续至少6小时。SLT40（10或20 μM）在AD293wt细胞中显示膜定位荧光，但也在AD293细胞中检测到非特异性结合，且在DK-MGhigh细胞中与EGFR阴性群体重叠。免疫细胞化学显示SLT40在DK-MGlow细胞中可能与EGFRwt结合，但存在非特异性信号。SLT41因背景高且荧光弱，结果不可靠。

**Intact LC-HRMS supports stable EGFR–ligand adduct formation**：完整蛋白质LC-HRMS分析显示，无配体EGFR蛋白去卷积质量为38,252.7 Da。与SQI-2、SLT40和SLT41孵育后，分别出现加合物质量38,797.3 Da（+544.6 Da）、38,739.5 Da（+486.8 Da）和38,721.1 Da（+468.5 Da），与预期质量偏移一致。阳性对照阿法替尼产生+485.8 Da偏移，而可逆抑制剂厄洛替尼（erlotinib）未产生相应加合物，证实了稳定共价加合物的形成。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，这些化合物可作为研究异质性细胞群体（如EGFR水平不同或携带EGFRvIII突变的细胞）的工具，用于细胞化学诊断（如肺癌检测），并可能用于光动力治疗和手术导航。然而，SLT40和SLT41在免疫细胞化学中显示出非特异性结合，且SLT41荧光弱，限制了其应用。此外，由于这些化合物导致EGFRvIII和EGFRwt在细胞内积累，与抗EGFRvIII CAR-T细胞联合治疗的策略不可行。完整蛋白质质谱虽支持共价加合物形成，但需肽段水平LC-MS/MS确认具体修饰位点。微尺度热泳（MST）因化合物自荧光干扰无法获得可靠结合亲和力K_D值。结论翻译如下：**结论**：所测试分子的共价对接产生以阿法替尼样（S）-构型在C_β和溶剂暴露的荧光臂（苯乙烯基或芳基乙炔基）为特征的构象。这些化合物在活性与非活性激酶结构域中均以类似构象对接。完整蛋白质LC-HRMS分析支持SQI-2、SLT40和SLT41形成稳定的EGFR-配体加合物，符合在实验条件下对EGFR激酶结构域的共价修饰。体外研究表明，所研究的化合物作为EGFR及其突变体的抑制剂。由于其内源性荧光（无需额外荧光团共轭至抑制剂），特别是SQI-2，以及程度较小的SLT40，这些化合物可作为以EGFR为中心的细胞研究工具，但在考虑更广泛的诊断或治疗应用前需进一步优化。