肿瘤来源的miR-126通过超越局部肿瘤环境的免疫调节促进肿瘤进展

《Frontiers in Oncology》：Tumor-derived miR-126 promotes tumor progression through immune modulation beyond the local tumor environment

　　

表皮生长因子样结构域7 (EGFL7)被发现是一种具有EGF样结构域和血管生成及血管发生功能的细胞外基质蛋白。它还通过减少血管内皮细胞上细胞黏附分子的表达来减弱免疫细胞的外渗，从而在肿瘤细胞的免疫逃逸中发挥作用。此外，编码于Egfl7基因内含子内的微小RNA-126 (miR-126)已被报道为一种血管生成因子。然而，其在肿瘤中的免疫相关功能仍不清楚。在此，研究人员使用Egfl7/Mir-126敲除和回补肿瘤细胞系，研究了肿瘤来源的EGFL7和miR-126在体内肿瘤进展中的作用。在Egfl7/Mir-126缺陷细胞中，肿瘤生长显著受抑制，而通过重新表达miR-126（而非EGFL7）可恢复肿瘤生长。这些体内肿瘤生长的差异在免疫缺陷小鼠中未观察到，提示适应性免疫系统的参与。CD4⁺或CD25⁺细胞耗竭抑制了表达miR-126的肿瘤的生长，而CD8⁺细胞耗竭则增强了miR-126缺陷肿瘤的生长。组织学分析显示，在肿瘤建立的早期阶段，表达miR-126的肿瘤中Foxp3⁺/CD8⁺细胞比例升高。双侧肿瘤模型进一步表明，表达miR-126的肿瘤促进了对侧miR-126缺陷肿瘤的生长，使用凋亡的miR-126表达肿瘤细胞也观察到类似效果。利用死亡肿瘤细胞来源的细胞外囊泡进行的体外分析显示，miR-126被转移至CD4⁺ T细胞，并且Foxp3⁺细胞比例更高。总之，这些发现表明肿瘤来源的miR-126通过非局部免疫调节促进肿瘤进展，可能涉及Treg相关群体的维持。

论文解读文章

研究背景与目的：
表皮生长因子样结构域7 (EGFL7) 是一种具有EGF样结构域的细胞外基质蛋白，最初因其血管生成和血管发生功能而被发现。后续研究显示，EGFL7可通过降低血管内皮细胞上细胞黏附分子（如细胞间黏附分子-1 (ICAM-1) 和血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1)）的表达，抑制免疫细胞的外渗，从而参与肿瘤细胞的免疫逃逸。同时，编码于Egfl7基因第七内含子内的微小RNA-126 (miR-126) 也被证实是一种血管生成因子，其成熟产物miR-126-3p和miR-126-5p通过调控靶RNA（如Vegf-a、Spred1、Pi3k2r）影响血管生成。然而，关于miR-126在肿瘤免疫调节中的功能，尤其是其是否超越局部肿瘤微环境发挥作用，仍不清楚。现有研究对EGFL7和miR-126在血管生成中的协同或拮抗关系存在争议，且缺乏miR-126表达肿瘤与免疫应答之间关系的报道。因此，本研究旨在明确肿瘤来源的EGFL7和miR-126在体内肿瘤进展中的作用，并探讨其免疫调节机制，特别是是否涉及非局部作用。该研究发表于《Frontiers in Oncology》。

主要关键技术方法：
研究人员采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在E.G7-OVA（小鼠胸腺瘤EL4细胞转染卵清蛋白 (OVA) 基因）和Colon-26（小鼠结肠腺癌细胞）两个细胞系中敲除Egfl7/Mir-126基因，构建了敲除细胞系（KO）。随后通过逆转录病毒载体分别回补miR-126或Egfl7，获得回补细胞系（RQ）。动物实验使用免疫正常C57BL/6小鼠、免疫缺陷NOD-scid Il2rgnull (NSG) 小鼠和BALB/c小鼠。通过皮下移植模型评估肿瘤生长，采用抗体介导的体内免疫细胞耗竭实验（抗CD4、抗CD8、抗CD25抗体），组织学免疫组化染色（CD8和Foxp3），以及双侧肿瘤模型和凋亡体转移实验。体外实验通过凋亡体制备（X射线照射诱导凋亡）、差速离心收集凋亡体，共培养 naive CD4⁺ T细胞，定量PCR检测miR-126转移，流式细胞术分析CD4⁺ T细胞中Foxp3⁺细胞比例。

研究结果：
3.1 Mir-126但非Egfl7缺失的肿瘤在体内显示生长迟缓：通过CRISPR-Cas9制备的E.G7-OVA KO细胞（缺乏Egfl7和miR-126）在体外增殖率与野生型（WT）和回补细胞（RQ）相似，且基于OVA抗原的IFN-γ产生能力无差异。然而，在免疫正常C57BL/6小鼠中，KO肿瘤生长显著受抑制，而回补miR-126（而非Egfl7）可恢复肿瘤生长。在免疫缺陷NSG小鼠中，各组肿瘤生长无显著差异，表明差异依赖于适应性免疫系统。在Colon-26细胞中也观察到类似结果，证实miR-126而非EGFL7与体内肿瘤生长差异相关。

3.2 表达miR-126的肿瘤在体内快速生长，与CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤反应受损相关：体内抗体耗竭实验显示，对于KO肿瘤，CD8⁺细胞耗竭显著促进肿瘤生长，而CD4⁺或CD25⁺细胞耗竭无影响。对于WT和RQ肿瘤，CD4⁺或CD25⁺细胞耗竭显著抑制肿瘤生长，但联合耗竭CD4⁺和CD8⁺细胞后此抑制效应消失。这表明在miR-126表达肿瘤中，CD4⁺CD25⁺ Treg相关群体可能抑制CD8⁺ CTL介导的抗肿瘤反应。

3.3 Foxp3⁺细胞在早期主要在表达miR-126的肿瘤中出现：第7天（肿瘤大小尚未出现差异时），miR-126表达RQ肿瘤中Foxp3⁺/CD8⁺细胞比例显著高于KO肿瘤，而第14天（RQ肿瘤更大）时此差异消失。提示miR-126相关的免疫调节可能在肿瘤建立的早期阶段发挥作用。

3.4 与表达miR-126的肿瘤相关的非局部免疫调节：双侧肿瘤模型显示，当左侧移植miR-126表达肿瘤（WT或RQ）时，右侧的KO肿瘤生长加速；而左侧移植KO细胞不影响右侧KO肿瘤生长。使用辐照后的凋亡RQ细胞替代活细胞移植，同样可促进右侧KO肿瘤生长，表明凋亡细胞介导了非局部免疫调节。

3.5 死亡肿瘤释放含有microRNA的凋亡体并将其转移至T细胞：体外实验证实，从RQ细胞制备的凋亡体中miR-126含量显著高于KO细胞凋亡体。将RQ凋亡体与naive CD4⁺ T细胞共培养6小时后，T细胞中miR-126-3p和miR-126-5p水平升高，表明miR-126可通过凋亡体转移至T细胞。

3.6 从表达miR-126的肿瘤细胞制备的凋亡体在体外与CD4⁺ T细胞中Foxp3⁺细胞群体的维持相关：CD4⁺ T细胞暴露于RQ凋亡体后，经CD3/CD28刺激和IL-2培养，流式分析显示CD4⁺ T细胞中Foxp3⁺细胞比例显著高于KO凋亡体处理组或对照组，提示miR-126可促进Foxp3⁺细胞群体的相对维持，但CTLA-4表达无显著变化。

结论与讨论总结：
本研究表明，肿瘤来源的miR-126（而非EGFL7）通过非局部免疫调节促进肿瘤进展，可能涉及早期肿瘤建立阶段Foxp3⁺细胞（Treg相关群体）的浸润以及通过凋亡体将miR-126转移至CD4⁺ T细胞，从而维持Foxp3⁺细胞群体。研究结论翻译如下：本研究发现，肿瘤miR-126可能与超越局部肿瘤效应的免疫调节和肿瘤生长相关，尤其是在肿瘤形成的早期阶段，可能涉及Foxp3⁺细胞浸润。通过凋亡体将miR-126从肿瘤转移至T细胞可能有助于维持Foxp3⁺细胞群体，这与双侧肿瘤模型中观察到的超越局部肿瘤环境的免疫调节相关。进一步研究肿瘤miR-126表达和释放的调控机制及其在T细胞中的作用，可能为开发控制肿瘤免疫逃逸的新策略提供依据。