《Frontiers in Microbiology》：Characterization of the effects of nitrate and tungstate, alone or combined, and Salmonella Newport inoculation on rumen microbiota, fermentation, and Salmonella survivability in vitro
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反刍动物摄入硝酸盐可能富集肠道内具有硝酸盐呼吸作用的沙门氏菌(Salmonella)。为验证钨酸盐（硝酸盐还原酶抑制剂）是否能阻止硝酸盐促进的沙门氏菌(Salmonella)富集，研究人员将接种或不接种104菌落形成单位(CFU)/mL Newport沙门氏菌
反刍动物摄入硝酸盐可能富集肠道内具有硝酸盐呼吸作用的沙门氏菌(Salmonella)。为验证钨酸盐（硝酸盐还原酶抑制剂）是否能阻止硝酸盐促进的沙门氏菌(Salmonella)富集，研究人员将接种或不接种104菌落形成单位(CFU)/mL Newport沙门氏菌(Salmonella Newport)的瘤胃微生物，在模拟瘤胃条件下分别添加或不添加10 mM硝酸盐、100 mM钨酸盐或其组合进行26 h孵育。结果表明，单独补充硝酸盐的瘤胃群体比硝酸盐与钨酸盐联合处理的群体代谢了更多的硝酸盐（p < 0.05），均值（±标准差）分别为8.55 ± 0.74和3.97 ± 0.67 μmol硝酸盐/mL。亚硝酸积累受钨酸盐处理影响（p < 0.05），未接种Newport沙门氏菌(S. Newport)时，单独补充硝酸盐或与钨酸盐联合处理的群体亚硝酸积累分别为4.96 ± 0.26和0.18 ± 0.07 μmol/mL；接种Newport沙门氏菌(S. Newport)时分别为1.95 ± 0.18和0.06 ± 0.01 μmol/mL。沙门氏菌(Salmonella)在单独或联合硝酸盐处理的钨酸盐处理群体中增加（p < 0.05）（分别为5.82 ± 0.10和5.57 ± 0.15 log10 CFU/mL），而对照组或仅补充硝酸盐的群体较低（分别为1.63 ± 0.58和2.84 ± 0.21 log10 CFU/mL）。在未接种Newport沙门氏菌(S. Newport)的群体中，添加硝酸盐、钨酸盐或其组合使野生型大肠菌群较未处理对照组（2.67 ± 0.18 log10 CFU/mL）增加了1.4至3.9 log10单位（p < 0.05）。在接种Newport沙门氏菌(S. Newport)的群体中，单独或联合硝酸盐的钨酸盐处理使大肠菌群较对照和仅硝酸盐补充群体（分别为3.06 ± 0.48和3.49 ± 0.06 log10 CFU/mL）增加了2.8至3.2 log10单位（p < 0.05）。野生型乳酸菌在钨酸盐处理及硝酸盐补充（单独或联合）下较未处理对照组（分别为6.84 ± 0.03和6.68 ± 0.16 log10 CFU/mL）富集了0.2至1.1 log10单位。无论单独或与钨酸盐联合，补充硝酸盐的群体甲烷产量较未处理或仅钨酸盐处理群体（分别为29.85 ± 5.05和23.08 ± 5.49 μmol甲烷/mL孵育液）降低了70%（p < 0.05）。这些结果表明，钨酸盐处理轻微降低了瘤胃群体中的硝酸盐代谢，但出乎意料地促进了沙门氏菌(Salmonella)的富集。
该研究发表于《Frontiers in Microbiology》。目前食源性沙门氏菌病(Salmonellosis)主要通过污染食物或水传播，涉及超过2500种肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型。反刍动物胃肠道内的沙门氏菌(Salmonella)可定植于肠黏膜并发生系统性易位。传统认为肠道沙门氏菌(Salmonella)主要通过发酵获取生长能量，但研究表明其可利用氧化氮化合物作为电子受体通过厌氧呼吸保存能量。宿主炎症反应产生的活性氮化合物及饲粮硝酸盐可增加肠道内硝酸盐来源，促进沙门氏菌(Salmonella)呼吸生长与定植。此外，为减排甲烷而添加的硝酸盐类饲料添加剂可能有利于牛瘤胃内沙门氏菌(Salmonella)的生长与携带。硝酸盐呼吸由含钼辅酶的酶（如甲酸脱氢酶(Fdh)、膜结合硝酸盐还原酶(NarG)、周质硝酸盐还原酶(NapA)）催化，而钨酸盐作为钼酸盐类似物可掺入这些酶使其失活从而抑制硝酸盐还原。然而，前期研究发现钨酸盐在抑制硝酸盐代谢的同时反而促进了沙门氏菌(Salmonella)生长，且对瘤胃野生大肠杆菌(Escherichia coli)和乳酸菌的影响尚不清楚。因此，研究人员开展本研究旨在表征硝酸盐、钨酸盐及其组合对体外瘤胃微生物孵育中接种的Newport沙门氏菌(S. Newport)、野生型大肠菌群和乳酸菌的影响，并考察其对硝酸盐亚硝酸代谢活性及发酵的作用。
研究人员从一头11岁装有瘤胃瘘管的泽西公牛（饲喂以百慕大草为主的牧草）采集瘤胃液作为接种物，在厌氧CO2环境下进行体外批次培养。设置是否接种104 CFU/mL Newport沙门氏菌(S. Newport)以及是否添加10 mM硝酸盐、100 mM钨酸盐或其组合的因子设计，每处理设3个重复管，总孵育时间26 h于39 °C进行。分析指标包括气体产量与组成（气相色谱）、硝酸盐、亚硝酸盐、氨态氮（比色法）、挥发性脂肪酸(VFA)（气相色谱）、己糖发酵量与发酵效率的化学计量估算、还原当量平衡，以及Salmonella Newport、野生型大肠菌群、乳酸菌的活菌计数（平板涂布法），数据统计采用2×2×2因子设计的Tukey HSD检验（p ≤ 0.05）。
3 Results
3.1 Effects on Salmonella Newport, coliforms, and lactic acid bacteria
在接种Newport沙门氏菌(S. Newport)的瘤胃微生物群体中，钨酸盐的主效应（p < 0.01）及钨酸盐与硝酸盐的交互作用（p < 0.03）在孵育6 h和26 h均显著。钨酸盐处理（单独或联合硝酸盐）的Newport沙门氏菌(S. Newport)活菌数（log10 CFU/mL）比较未处理组高0.9至3.9 log10单位；仅补充硝酸盐组在26 h时高于对照组（p = 0.02）但6 h时无差异。野生型大肠菌群在6 h时无主效应差异（p ≥ 0.10），26 h时硝酸盐添加（p < 0.01）和钨酸盐处理（p < 0.01）的主效应显著，分别使大肠菌群增加约0.5和3.1 log单位，且存在接种与硝酸盐、接种与钨酸盐、硝酸盐与钨酸盐的交互作用（p = 0.02）。野生型乳酸菌在26 h时存在Newport沙门氏菌(S. Newport)接种（p < 0.01）、硝酸盐补充（p < 0.01）和钨酸盐处理（p < 0.01）的主效应，数值差异较小（0.1至0.63 log10单位），并存在接种与钨酸盐、硝酸盐与钨酸盐的交互作用（p < 0.01），无三者交互作用。
3.2 Effects on nitrate, nitrite, and ammonia accumulations
含硝酸盐的微生物群中，Newport沙门氏菌(S. Newport)接种（p < 0.01）、钨酸盐处理（p < 0.01）及其交互作用（p < 0.01）对硝酸盐代谢速率有影响，接种增加速率、钨酸盐降低速率。26 h时钨酸盐处理使硝酸盐代谢量减少47%（3.97 vs 8.55 μmol/mL，p < 0.01）；6 h时无差异（p = 0.55）。亚硝酸积累在6 h时仅受钨酸盐主效应影响（p < 0.01，无钨酸盐组0.97 vs 有钨酸盐组0.03 μmol/mL），26 h时受接种（p < 0.01）、钨酸盐（p < 0.01）及交互作用（p < 0.01）影响，趋势为未接种仅硝酸盐最高、接种仅硝酸盐居中、任何加钨酸盐最低。26 h亚硝酸消耗量受接种（p < 0.01，接种组多消耗24%）和钨酸盐（p = 0.01，钨酸盐组少消耗34%）主效应影响，无交互作用（p = 0.08）。氨积累受接种（p < 0.01）、硝酸盐（p < 0.01）、钨酸盐（p = 0.03）主效应及接种与钨酸盐交互作用（p = 0.02）影响，接种且钨酸盐处理组氨积累最高。
3.3 Effects on fermentation
硝酸盐补充主效应使总产气量降低34%（p < 0.01），甲烷产量降低70%（p < 0.01），且硝酸盐与钨酸盐存在交互作用（p = 0.05）。氢气积累受Newport沙门氏菌(S. Newport)接种主效应影响（p ≤ 0.01），接种组较高（平均0.12 vs 0.05 μmol H2/mL）。乙酸(C2)净产量受接种主效应影响（p = 0.02），接种组减少22%；丙酸(C3)受接种及接种与硝酸盐交互作用影响（p ≤ 0.01和p = 0.02）；丁酸(C4)受接种（p ≤ 0.01）和硝酸盐（p ≤ 0.01）主效应及接种与硝酸盐、三者交互作用影响（p = 0.02和p = 0.03），接种组较高、硝酸盐组较低。异丁酸(iC4)、戊酸(C5)、异戊酸(iC5)受硝酸盐主效应（p ≤ 0.01）和部分受钨酸盐主效应及交互作用影响，差异较小。pH受硝酸盐主效应影响（p ≤ 0.01）及三者交互作用（p = 0.03），差值不超过0.7单位。己糖(C6)发酵量和发酵效率不受主效应影响（p ≥ 0.09和p ≥ 0.83），但存在接种与硝酸盐及三者交互的效率差异（p = 0.04，差≤4%）。还原当量生成总量不受处理影响（p ≥ 0.08，范围88.42–135.20 μmol H2当量/mL）。还原当量消耗中，甲烷生产受硝酸盐主效应（p ≤ 0.01，减少75%）及硝酸盐与钨酸盐交互作用（p = 0.05）；VFA生产受硝酸盐主效应（p = 0.04）及接种与硝酸盐交互（p = 0.02）；硝酸盐代谢消耗受钨酸盐主效应（p ≤ 0.01）；亚硝酸代谢消耗受接种和钨酸盐主效应（p ≤ 0略01）。总还原当量消耗受硝酸盐（p ≤ 0.01）和钨酸盐（p = 0.03）影响，回收率受接种正影响（p = 0.01）和硝酸盐负影响（p ≤ 0.01）。
讨论部分指出，硝酸盐关联富集Newport沙门氏菌(S. Newport)与前人Correa et al., 2017及Anderson et al., 2026结果一致，对补硝酸盐动物的食品安全有意义。未加处理的对照组中病原菌和野生大肠菌群无明显增殖，符合体内瘤胃竞争环境抑制沙门氏菌(Salmonella)的观点。与Zhu et al., 2018和Yang et al., 2023报道钨酸盐抑制肠杆菌科不同，本研究及Anderson et al., 2026发现100 mM钨酸盐反而使Salmonella Newport和野生大肠菌群增加超3.5 log，推测钨酸盐（四配位氧）可能作为可还原氧源支持呼吸，且钨酸盐抑制了含钼的硝酸盐代谢酶，纯培养中钨而非钨酸盐抑制生长也支持此说。乳酸菌（非硝酸盐代谢者）在钨酸盐下也增0.4 log，提示氧可用性可能促进生长，高剂量钨酸盐可能对瘤胃其他菌有选择性毒性从而腾出生态位。钨酸盐虽抑制硝酸盐代谢（26 h代谢量适度降，速率降），但亚硝酸代谢也被抑制；本研硝酸盐剂量（10 mM）高于前研（5 mM）致26 h末亚硝酸峰值。甲烷在补硝酸盐（±钨酸盐）下降70%，但硝酸盐亚硝酸消耗仅解释约14–28%的甲烷降幅，其余还原当量可能用于菌体增长或其他途径（如脱氮至N2O或蛋白同化）。VFA产量高于前研，提示钨酸盐可能改变氧化还原电位。氨积累在硝酸盐组仅微增，推测部分氮以氧化氮或N2形式损失，或被增殖菌同化。
结论部分翻译：在本研究条件下，牛瘤胃微生物群的硝酸盐补充成功缓解了甲烷产生，但也伴随实验接种的Newport沙门氏菌(S. Newport)的富集。与预期相反，钨酸盐处理促进了实验接种的Newport沙门氏菌(S. Newport)以及野生型大肠菌群和乳酸菌群体的增殖，从而否定了此处所用浓度的钨酸盐会明确抑制硝酸盐呼吸细菌生长的概念。结果还表明钨酸盐效应并不限于硝酸盐呼吸细菌，并暗示但在本研究中未证明在钨酸盐存在下乳酸菌与Newport沙门氏菌(S. Newport)之间存在潜在竞争。在本研究使用的浓度下，合理推测与四个氧原子结合的钨酸盐可能作为电子受体（直接或间接作为释放氧的来源）支持了本孵育系统中的能量保存。虽然看似矛盾，但本研究使用较高量钨酸盐（相较多数早期实验≤15 mM）可能导致了关于细菌生长的差异结果；概念上较低钨酸盐剂量可能足以抑制硝酸盐呼吸的能量保存但不足以提供足够氧支持显著的有氧呼吸生长，此假设尚待验证。尽管如此，本研究结果表明需要进一步研究以理解饲喂硝酸盐的反刍动物中沙门氏菌(Salmonella)富集的潜力及其对食品安全的意义，并调查最终可实现胃肠道安全有效控制沙门氏菌(Salmonella)的钨酸盐条件与剂量。本研究局限性包括使用单一高剂量钨酸盐和硝酸盐、高Newport沙门氏菌(S. Newport)接种量、缺乏来自单一供体群体的宏基因组和转录组分析。未来研究纳入基于分子的群体研究及/或氧释放、消耗、氧化还原电位和钨酸盐或其潜在代谢产物对来自多头动物的瘤胃群体的毒性测量，并最终在体内进行，将提供有用的功能性生态系统表征。
