《Frontiers in Microbiology》：Complete genome sequence and mass spectrometry assist mining siderophore turnerbactin analogs in a non-model Pseudoduganella strain with biocontrol potential
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与植物相关的生物防治细菌通过减少对有毒化学农药的依赖，在推动可持续农业中发挥关键作用。伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）是一个尚未充分开发但极具前景的微生物类群，其特点是生态分布广泛，在可持续农业系统中具有相当大的应用潜力。在本研究中，研究人员旨
与植物相关的生物防治细菌通过减少对有毒化学农药的依赖，在推动可持续农业中发挥关键作用。伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）是一个尚未充分开发但极具前景的微生物类群，其特点是生态分布广泛，在可持续农业系统中具有相当大的应用潜力。在本研究中，研究人员旨在分离和鉴定一株属于伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）的潜在生物防治菌株，以促进生态友好型农业实践并挖掘此前未开发的次级代谢产物。从苍马山分离出一株新型细菌菌株Pseudoduganella sp. D-3-1，其特征是具有强效抗真菌活性和高铁螯合能力。全基因组测序显示，其完整基因组大小为6,875,892 bp，编码6,035个预测编码序列（CDS），包括一个完整的紫色杆菌素（violacein）生物合成途径。基因组挖掘发现了一系列次级代谢产物生物合成基因簇（BGC），特别是一个非核糖体肽合成酶（NRPS）基因簇，命名为pseudodubactin簇，其编码一种与turnerbactin结构相关的儿茶酚型铁载体。通过高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）、基因敲除、异源表达和生物信息学分析，首次从Pseudoduganella sp.中鉴定出4种turnerbactin类似物（1-4），包括两种新化合物：pseudodubactin A（2）和pseudodubactin B（4）。此外，HR-ESI-MS分析检测到两种未表征的铁载体，命名为化合物5和化合物6，它们在结构上与turnerbactin类似物不同。这些发现表明Pseudoduganella sp. D-3-1是生物活性天然产物，特别是紫色杆菌素（violacein）和多种铁载体的有前景来源，突出了其作为可持续和生态友好型农业生物防治剂的潜力。
植物病原体对全球农业生产构成严重威胁，导致主要作物产量损失。传统化学农药虽有效，但环境与健康问题日益突出，生物防治作为可持续、环保的无毒替代方案受到广泛关注。伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）是一个生态分布广泛但尚未充分开发的微生物类群，其成员如Burkholderia和Paraburkholderia已显示出作为生物防治剂（BCA）的潜力，能产生多种次级代谢产物，包括铁载体（siderophore）。铁载体是微生物在铁限制条件下分泌的低分子量化合物，在铁获取、生物修复和农业增产中发挥重要作用。然而，Burkholderiales中Pseudoduganella属的研究极为有限，其分类地位和次级代谢产物生产能力尚不明确。因此，研究人员旨在从该属中分离并鉴定一株具有生物防治潜力的新菌株，挖掘此前未开发的次级代谢产物，为可持续农业提供新资源。
研究人员从中国山东省苍马山土壤中分离到一株新菌株Pseudoduganella sp. D-3-1，通过16S rRNA基因和全基因组测序分析，确定其属于Pseudoduganella属新种。该菌株表现出强抗真菌活性和铁螯合能力。全基因组测序显示其基因组大小为6,875,892 bp，编码6,035个预测编码序列（CDS），包含完整的紫色杆菌素（violacein）生物合成途径和多个次级代谢产物生物合成基因簇（BGC）。通过高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）、基因敲除、异源表达和生物信息学分析，首次从Pseudoduganella sp.中鉴定出4种turnerbactin类似物（1-4），包括两种新化合物pseudodubactin A（2）和pseudodubactin B（4），并检测到两种未表征的铁载体（化合物5和6）。该研究首次全面揭示了Pseudoduganella菌株的生物合成潜力，为开发新型生物防治剂提供了基础，相关成果发表在《Frontiers in Microbiology》。
为开展研究，研究人员采用了以下关键技术方法：样本来源为山东省苍马山土壤。全基因组测序结合第二代Illumina和第三代Nanopore技术完成组装。基因组挖掘通过antiSMASH 8.0.1预测BGC。代谢产物分析采用高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）进行分子鉴定和碎裂模式分析。遗传操作方面，建立了基于Redγ-BAS的重组系统，用于基因敲除vio和pdb BGC；通过ExoCET方法直接克隆pdb BGC并在异源宿主B. gladioli ATCC 10248Δgbn-attB中表达。铁载体检测采用CAS琼脂法，抗菌活性通过滤纸片扩散法测定。
3.1 Pseudoduganella sp. D-3-1的鉴定和基因组序列分析：通过16S rRNA基因和全基因组序列分析，菌株D-3-1被鉴定为Pseudoduganella属新种，基因组大小为6,875,892 bp，GC含量62.88%，编码6,035个CDS，包含14个BGC，其中BGC4为完整的紫色杆菌素（violacein）生物合成途径，BGC14为与turnerbactin相关的NRPS（非核糖体肽合成酶）基因簇（pseudodubactin簇）。
3.2 次级代谢产物的生物活性筛选：采用OSMAC（一菌多化合物）策略，乙酸乙酯粗提物表现出对茄病镰刀菌（Fusarium solani）的抗真菌活性，以及对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗菌活性；CAS琼脂法证实铁载体产生。
3.3 Turnerbactin类似物铁载体的鉴定：HR-ESI-MS分析在铁限制条件下检测到4种turnerbactin类似物（1-4），包括两个新化合物pseudodubactin A（2）和pseudodubactin B（4），以及两种未表征铁载体（化合物5和6）。MS/MS碎裂模式确认1-4为turnerbactin结构类似物，但线性三聚体turnerbactin未被检测到。
3.4 利用重组系统敲除pdb和vio BGC：通过评估三种重组系统，确定Redγ-BAS为有效工具，成功敲除vio BGC（紫色杆菌素簇）和pdb BGC（pseudodubactin簇）。HR-ESI-MS分析显示双突变株D-3-1ΔvioΔpdb中化合物1-4完全消失，而化合物5-6仍可检测但产量降低；异源表达实验证实pdb BGC负责合成化合物1-4。
3.5 Pseudodubactin生物合成基因簇：pdb BGC编码DHB（2,3-二羟基苯甲酸）合成和NRPS（非核糖体肽合成酶）组装线，与tnb BGC高度同源，首次在Burkholderiales（伯克霍尔德菌目）中报道。该基因簇在Pseudoduganella、Massilia、Duganella等β-变形菌纲和γ-变形菌纲中保守，可能参与微生物互作或植物-微生物共生。
在讨论部分，研究人员指出Pseudoduganella sp. D-3-1属于Burkholderiales（伯克霍尔德菌目），是生物防治的新候选菌株。该菌株能合成至少两种铁载体，包括儿茶酚型turnerbactin类似物和未表征铁载体，以及紫色杆菌素（violacein）。pdb BGC主要合成线性二聚体turnerbactin类似物，而非线性三聚体，这与异源表达结果一致。脱水丝氨酸残基的形成机制尚不明确，需进一步研究。新化合物2和4因产量低和极性相似，未能通过核磁共振（NMR）完全鉴定。未表征铁载体5和6的结构与NRPS代谢物不同，其生物合成基因簇有待通过基因组挖掘和基因敲除确定。pdb BGC的广泛分布暗示其保守的生态功能。研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员成功表征了一株新菌株Pseudoduganella sp. D-3-1，该菌株表现出强抗真菌活性和铁载体产生能力。建立了功能性遗传重组系统，实现了vio和pdb BGC的靶向敲除。四种turnerbactin类似物被鉴定为pdb BGC合成的代谢产物，标志着此类化合物在Pseudoduganella属中的首次报道。结合基因组挖掘、基于质谱的代谢物谱分析、基因敲除和异源表达实验的综合分析表明，Pseudoduganella sp. D-3-1拥有多样化的次级代谢产物库，其中铁载体是主要生物活性成分。总之，这项工作首次全面揭示了Pseudoduganella菌株的生物合成潜力，并突出了其作为新型生物防治剂的前景，为在可持续农业和生物技术中的未来应用奠定了基础。
