治疗性噬菌体与氨曲南通过核壳电纺纤维的共递送用于协同抗铜绿假单胞菌感染

《International Journal of Pharmaceutics》：Co-delivery of therapeutic bacteriophages and aztreonam via core–shell electrospun fibers for synergistic action against Pseudomonas aeruginosa infections

　　

•JG004和氨曲南对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）表现出协同杀灭作用。•电纺聚乙烯吡咯烷酮（PVP）核壳纳米纤维能够实现JG004和氨曲南的共递送。•制剂平台在≥28天内保持噬菌体感染性和抗菌活性。•生物相容性和模块化系统支持临床转化。•在浮游和生物膜相关状态下，细菌清除率高达99%。

**论文解读**

**研究背景与问题**
全球抗菌素耐药性（AMR）已成为公共卫生重大威胁，尤其对世界卫生组织列为“高优先级”的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其耐药机制包括靶点修饰、酶降解和主动外排泵，严重限制常规抗菌药效。在慢性伤口感染中，组织灌注不良、异质组织结构和持续性生物膜进一步阻碍药物渗透，生物膜改变细菌代谢、降低抗菌药可及性并维持顽固亚群，使治疗极为困难。溶菌噬菌体因其选择性裂解细菌和降解胞外聚合物（EPS）的能力而成为替代策略，但单一噬菌体疗法面临耐药性、复杂伤口环境活性不稳定及储存/应用易失活等局限。噬菌体-抗生素协同（PAS）可互补机制、减少耐药性并增强杀菌效果，然而将PAS转化为慢性伤口护理受制于噬菌体在潮湿环境中的不稳定性、活性成分在生物膜组织中的分布不良以及缺乏能同时稳定两种药物的载体系统。现有递送系统（如水凝胶、藻酸盐敷料、喷雾制剂和冻干粉）在噬菌体稳定性、作用位点保留及与抗生素协调递送方面仍存挑战。电纺纳米纤维因高比表面积、可调溶解动力学和良好伤口附着力而成为有前景的噬菌体递送平台，但需开发能稳定共递送噬菌体和抗生素的制剂以充分利用PAS。因此，研究人员开展本研究，旨在开发一种基于纳米纤维的共递送平台，用于治疗慢性伤口中铜绿假单胞菌感染。论文发表在《International Journal of Pharmaceutics》。

**研究内容与结论**
研究人员设计了以水溶性聚合物聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为壳层、溶菌噬菌体JG004封装于内芯、β-内酰胺抗生素氨曲南加载于壳层的核壳电纺纤维系统。通过系统表征（纤维形态、分子组成、物理性能、生物相容性）及对浮游和生物膜态铜绿假单胞菌PAO1的抗菌评价，得出以下结论：核壳结构在制备和储存中保护噬菌体感染性，氨曲南含量稳定；两者协同作用显著，浮游和生物膜态细菌清除率高达99%，优于单药治疗；系统在室温下储存28天后仍保持抗菌活性，且在4°C和?20°C下更稳定；生物相容性良好，无细胞毒性或炎症反应。该研究首次将电纺纳米纤维与PAS机制结合，为局部抗感染治疗提供了可模块化的平台，有望转化为针对慢性伤口感染的个性化策略。

**主要关键技术方法**
1. **共轴电纺技术**：采用核壳喷丝头，以PVP/溶剂（DMF/甲醇）为壳溶液、噬菌体裂解液或缓冲液为芯溶液，制备核壳纳米纤维（来源：德国DSMZ提供的菌株PAO1和噬菌体JG004）。
2. **扫描电子显微镜（SEM）**：表征纤维形态、直径分布及细菌形态变化（如氨曲南诱导的丝状化）。
3. **衰减全反射红外光谱（ATR-IR）**：确认纤维中活性成分的结构完整性。
4. **高效液相色谱（HPLC）**：定量氨曲南含量、包封效率及储存稳定性。
5. **双层琼脂法（DLA）**：检测噬菌体感染性滴度及释放曲线。
6. **棋盘法**：评估噬菌体与氨曲南的协同作用（通过FICI₉₀分析）。
7. **生物相容性测试**：采用人角质形成细胞HaCaT，通过结晶紫染色、MTT法、乳酸脱氢酶（LDH）释放和IL-6 ELISA评估细胞毒性、膜完整性和炎症反应。

**研究结果**
**杀菌协同作用研究**
通过棋盘法（synogram）分析，氨曲南单独处理在≥最低抑菌浓度（MIC，10 μg/mL）时呈浓度依赖性抑制；噬菌体JG004单独处理仅产生轻微抑制（19%–67%）。两者联合在亚抑菌浓度氨曲南（2.5 μg/mL，?×MIC；5 μg/mL，?×MIC）与高滴度噬菌体（≥10⁶ PFU/mL）时，光密度（OD₆₀₀）降低>90%，显示协同杀菌效应，无拮抗。

**抗生素对细菌形态的影响**
SEM图像显示，未经处理的铜绿假单胞菌呈典型杆状，而暴露于?×MIC氨曲南后细菌出现显著丝状化，提示细胞分裂抑制和细胞壁合成受损，可能增强噬菌体吸附。

**纳米纤维的制备与形态**
所有配方（空白、氨曲南加载、噬菌体加载、双加载）均呈现光滑、无缺陷、随机取向纤维，平均直径约524–558 nm，无显著差异。共聚焦显微镜证实核壳结构，荧光标记的芯溶液定位于纤维内部。

**纤维组成光谱分析**
ATR-IR光谱显示，PVP特征峰（如1650 cm^?1的C=O伸缩）和氨曲南特征峰（如1789 cm^?1的羰基伸缩、1063 cm^?1和1260 cm^?1的SO伸缩）在复合纤维中保留，但氨曲南峰红移10 cm^?1；噬菌体信号因低浓度被掩盖，但感染性保留表明结构完整。

**纳米纤维的物理化学表征**
动态接触角测量显示所有配方在120 ms内接触角从约72°降至约16°，随后完全吸收，表明快速润湿性。拉伸测试显示，纤维垫在平行于收集器旋转方向时杨氏模量更高（62–120 MPa），垂直于方向时伸长率更大（17–18%），机械性能足以支持操作。

**药物与噬菌体含量、稳定性及释放**
电纺后噬菌体滴度仅下降约0.8 log₁₀，双加载与单加载无显著差异。室温储存14天后滴度下降（单加载：1.2–3.3 log₁₀；双加载：0.9–2.1 log₁₀），28天后无活性；4°C储存下降0.4–1.1 log₁₀；?20°C下降0.3–0.8 log₁₀。氨曲南包封效率约91%，28天内含量无显著变化。释放实验显示，噬菌体和氨曲南均在5分钟内快速释放>85%，随后保持稳定，双加载与单加载释放曲线无显著差异。

**体外生物相容性评估**
使用HaCaT角质形成细胞暴露于纤维洗脱液（0.5–100% v/v）24小时。结晶紫染色显示细胞形态正常，无毒性；MTT法显示代谢活性无显著降低；LDH释放维持在基线水平，表明膜完整性；IL-6分泌与未处理对照组相当，仅炎症对照（LPS/IFN-γ）显著升高（31.00 pg/mL），证明系统无细胞毒性、刺激或炎症反应。

**抗菌性能**
**抑制圈测试**：即时装药后，双加载纤维抑制圈直径（28.7 mm）显著大于单加载（氨曲南：25.0 mm；噬菌体：10.0 mm）。室温储存4周后，氨曲南和双加载纤维抑制圈稳定（26.4–27.5 mm），噬菌体纤维活性下降至几乎消失；4°C和?20°C下所有配方保持活性。
**浮游细菌处理**：双加载纤维处理组在24小时内OD₆₀₀持续下降至基线，无再生长；而噬菌体纤维处理组在8小时后出现再生长，氨曲南纤维处理组在4小时后达到峰值后下降但仍高于基线。
**生物膜处理**：成熟生物膜（初始1.79×10⁹ CFU/mL）经双加载纤维处理24小时后，CFU降至3.00×10⁶ CFU/mL（log₁₀降低2.58），显著优于氨曲南（log₁₀降低1.79）和噬菌体（仅初期降低后恢复）。延长至72小时，双加载纤维在24–48小时额外降低约0.5 log₁₀，随后变化微小。

**讨论部分总结**
研究证实氨曲南与噬菌体JG004在亚抑菌浓度下存在PAS，丝状化形态可能增强噬菌体吸附，但机制尚需进一步阐明。电纺核壳纤维系统成功实现两种活性成分的稳定共递送，PVP壳层快速溶解、生物相容性良好，且双加载在浮游和生物膜模型中均优于单药，有效防止细菌再生长和耐药性形成。该平台为首次将PAS纳入纳米纤维设计，模块化特性支持不同噬菌体-抗生素组合的个性化抗感染策略。

**研究结论部分翻译**
为应对多重耐药病原体日益增长的威胁，研究人员开发了一种双作用纳米纤维药物递送系统，利用溶菌噬菌体JG004和β-内酰胺抗生素氨曲南之间的协同相互作用。通过将两种活性成分空间分离于核壳结构中，该系统在制备和储存期间保持噬菌体感染性，同时维持至少四周的抗菌效力。所得制剂在浮游和生物膜相关状态下均实现了对铜绿假单胞菌PAO1的卓越细菌清除，始终优于相应的单药治疗。相互作用分析证实了噬菌体-抗生素协同，而SEM揭示了氨曲南诱导的形态学改变，可能增强了噬菌体易感性。除了良好的机械性能、快速溶解动力学和已证明的生物相容性外，这些发现突显了该平台作为局部、抗耐药性治疗方法的潜力。重要的是，纳米纤维设计的模块化特性允许适应不同的噬菌体-抗生素配对和病原体，为个性化或适应症特异性抗感染策略提供了灵活途径。这项工作为将噬菌体疗法整合到先进伤口护理中奠定了基础，并强调了工程化递送系统在解决持久性和顽固性细菌感染方面的前景。