《Frontiers in Immunology》：Pyruvate kinase M2 is elevated in systemic sclerosis and plays a role in its pathogenesis
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背景：系统性硬化症是一种以免疫激活和纤维化为特征的自身免疫性纤维化皮肤病。成纤维细胞是该纤维化过程的核心，分化为效应肌成纤维细胞；然而，该过程的驱动因素仍然不清楚。最近，研究人员在纤维化疾病中发现了细胞代谢变化，观察到三羧酸（TCA）循环和糖酵解的改变。目的：
背景：系统性硬化症是一种以免疫激活和纤维化为特征的自身免疫性纤维化皮肤病。成纤维细胞是该纤维化过程的核心，分化为效应肌成纤维细胞；然而，该过程的驱动因素仍然不清楚。最近，研究人员在纤维化疾病中发现了细胞代谢变化，观察到三羧酸（TCA）循环和糖酵解的改变。目的：本研究的目的是阐明糖酵解酶丙酮酸激酶M2（PKM2）在系统性硬化症中的作用。方法：收集早期弥漫性系统性硬化症（SSc）患者和健康对照（HC）的血清，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分析PKM2。从HC和SSc活检组织中分离成纤维细胞，并用转化生长因子-β1（TGF-β1）处理以评估PKM2表达。对PKM2进行药理学调节，并评估胶原蛋白和细胞外基质（ECM）调节因子。使用Seahorse分析评估代谢活性，并化学抑制乳酸转运。使用组蛋白乳酸化特异性或同型抗体进行染色质免疫沉淀，并进行乳酸或醋酸盐补充实验。结果：研究人员发现SSc患者循环和成纤维细胞中的PKM2显著升高。通过TGF-β1暴露可诱导健康成纤维细胞中的PKM2表达。此外，PKM2驱动糖酵解的代谢转变，可通过强制PKM2从二聚体形式四聚化来阻断；这导致ECM和基质调节因子减少。机制上，PKM2介导的糖酵解导致乳酸升高，通过组蛋白H3K18乳酸化的表观遗传调控驱动胶原蛋白。阻断PKM2二聚化降低了胶原蛋白启动子处的组蛋白H3赖氨酸18（H3K18）乳酸化，这可通过乳酸而非醋酸盐恢复。研究人员进一步证明，乳酸诱导的胶原蛋白部分由缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）介导。结论：PKM2通过糖酵解等代谢变化驱动SSc中成纤维细胞的活化。利用PKM2四聚化或阻断乳酸生成可能成为治疗选择有限的疾病的一种潜在治疗策略。
**研究背景与问题**
系统性硬化症（SSc）是一种自身免疫性结缔组织疾病，以炎症、血管稀少和纤维化为三大特征。纤维化主要累及皮肤，并可影响肺和心脏等内脏器官，在所有炎症性风湿病中病死率最高。尽管过去十年取得进展，但仍无有效疗法改变纤维化成分。纤维化的关键细胞类型是肌成纤维细胞，它源于静止的成纤维细胞，获得高度收缩表型并产生过量细胞外基质（ECM）。经典激活因子是转化生长因子-β1（TGF-β1），但肌成纤维细胞生成的具体机制尚不明确。近期研究提示代谢和糖酵解在纤维化中发挥作用，研究人员已证明糖酵解抑制可减少体内肾纤维化中肌成纤维细胞积累，并在SSc成纤维细胞中发现糖酵解和谷氨酰胺分解是肌成纤维细胞生成的重要事件。低氧在SSc中普遍存在，代谢紊乱已被证实，因此研究人员试图探究糖酵解限速酶丙酮酸激酶M2（PKM2）在SSc中的作用。PKM2有低活性的二聚体和高活性的四聚体两种形式，二聚体促进有氧糖酵解并可转位至细胞核调控基因转录，在癌症中与“瓦博格效应”相关，近年也被发现参与肝、肾和肺纤维化。本文旨在阐明PKM2在SSc中的致病角色，并探讨其作为治疗靶点的可能性。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。
**主要研究方法**
研究纳入30例早期弥漫性SSc患者（英国纽卡斯尔医院信托基金，病程<2年，符合美国风湿病学会标准）和30例年龄性别匹配的健康对照（HC）。采集血清进行PKM2 ELISA检测。从SSc和HC皮肤活检分离真皮成纤维细胞（传代1-5代）。使用TGF-β1（10 ng/ml）刺激健康成纤维细胞，并应用TGF-β受体抑制剂SB431542、Smad3抑制剂SIS3、PKM2四聚化激动剂TEPP-46和DASA-58、乳酸转运体MCT-1抑制剂syrosingopine、HIF-1α抑制剂PX-478、GPR81拮抗剂3-OBA、JAK抑制剂tofacitinib等。通过Seahorse XFp分析仪测量细胞外酸化率（ECAR）评估糖酵解，使用乳酸检测试剂盒定量乳酸，采用Sircoll法测定胶原蛋白，ELISA检测TIMP-1、MMP-1、TGF-β1，qRT-PCR检测基因表达，染色质免疫沉淀（ChIP）使用抗H3K18La抗体检测胶原1A1启动子乳酸化。部分实验使用聚丙烯酰胺水凝胶模拟软（0.6 kPa）和硬（6 kPa）基质，以及条件培养基转移实验。5例SSc患者接受霉酚酸酯（MMF）治疗12个月后检测血清PKM2、皮肤乳酸和改良Rodnan皮肤评分（mRSS）。
**研究结果**
**PKM2在系统性硬化症中升高**
通过ELISA检测发现，早期弥漫性SSc患者循环PKM2水平显著高于HC（均值1.9 vs. 0.28 ng/ml，p≤0.0001）。SSc真皮成纤维细胞中PKM2基因表达较HC升高2.4倍（p=0.0019）。血清PKM2与mRSS无相关性，但伴间质性肺病（ILD）患者PKM2更高。
**TGF-β1调控PKM2，SSc成纤维细胞分泌PKM2调节因子**
TGF-β1（10 ng/ml）刺激健康成纤维细胞20小时后，PKM2 mRNA升高2.8倍（p≤0.0001）。TGF-β受体抑制剂SB431542和Smad3抑制剂SIS3均显著阻断此诱导。SSc成纤维细胞条件培养基（CM）使健康成纤维细胞PKM2表达升高2.6倍（p=0.0053），中和TGF-β的1d11抗体有降低趋势但未达显著。硬水凝胶（6 kPa）上培养的成纤维细胞PKM2表达高于软水凝胶，YAP抑制剂verteporfin可降低此诱导（p=0.0401），提示机械张力通过YAP调控PKM2。
**强制PKM2四聚化减少SSc成纤维细胞纤维化**
SSc成纤维细胞经PKM2四聚化激动剂TEPP-46（40 μM）处理30小时后，胶原蛋白分泌减少（37.4 vs. 17.8 μg/ml，p=0.0007），肌成纤维细胞标志物ACTA2（α-SMA）表达降低（p≤0.0001），TIMP-1水平下降（p≤0.0002），而MMP-1无变化，TGF-β1表达无差异。细胞活力未受影响。另一种PKM2激动剂DASA-58同样减少胶原蛋白（p=0.0005）。
**PKM2驱动糖酵解，PKM2介导的乳酸调控ECM**
TEPP-46处理显著降低TGF-β1刺激的成纤维细胞ECAR（9.1 vs. 3.6 mpH/min/μg，p=0.0001），并减少糖酵解关键酶HK-2基因表达（降低52%，p≤0.0001）和乳酸水平（p=0.0019）。MCT-1抑制剂syrosingopine（10 μM）在TGF-β1存在下减少胶原蛋白（p=0.0001）和TIMP-1（p=0.0003），但CTGF和IL-6无显著变化。
**PKM2促进的乳酸通过乳酸化和HIF-1α调节成纤维细胞胶原蛋白**
ChIP实验显示，乳酸（20 mM）处理健康成纤维细胞后，胶原1A1启动子处H3K18乳酸化富集显著增加（p=0.001），并伴随胶原基因表达升高（p=0.0019）。P300/CBP抑制剂C646不能减少此富集，提示非P300介导。在SSc成纤维细胞中，TEPP-46降低胶原蛋白，外源性乳酸可恢复此效应，而醋酸盐无效。GPR81拮抗剂3-OBA不抑制乳酸诱导的胶原蛋白。乳酸处理使HIF-1α靶基因VEGF表达升高1.73倍（p=0.0029），抗氧化剂NAC可阻断（p=0.0180）。HIF-1α抑制剂PX-478显著抑制乳酸诱导的胶原蛋白（p=0.0441），而GPR81拮抗剂无效，提示HIF-1α部分介导此效应。
**乳酸介导的胶原蛋白独立于STAT3**
乳酸诱导的胶原蛋白不受JAK抑制剂tofacitinib影响，但IL-6转信号诱导的胶原蛋白被tofacitinib阻断（p=0.0003）。STAT3荧光素酶报告基因实验显示，乳酸不激活STAT3，而IL-6转信号明显激活，确认STAT3不参与乳酸胶原诱导。
**免疫调节治疗调控SSc患者PKM2**
5例SSc患者接受MMF治疗12个月后，血清PKM2水平显著降低（80%患者降低，p=0.0383），伴随mRSS临床改善（平均ΔmRSS -7.4，p=0.0407，4/5改善>25%），皮肤活检乳酸水平也降低（p=0.0113）。ΔPKM2与ΔmRSS无显著相关性（R2=0.25，p=0.40），ΔPKM2与Δ组织乳酸亦无相关（R2=0.0004，p=0.973）。
**讨论与结论**
研究人员发现SSc中PKM2升高，TGF-β1通过SMAD3依赖机制及机械张力（YAP介导）上调PKM2。PKM2二聚体形式驱动糖酵解，产生乳酸，乳酸通过组蛋白H3K18乳酸化（非P300介导）和HIF-1α稳定化（通过ROS）促进胶原蛋白表达，此过程不依赖GPR81或STAT3。强制PKM2四聚化（TEPP-46或DASA-58）减少ECM沉积，MCT-1抑制也减少纤维化。MMF治疗可降低PKM2、乳酸和mRSS。结论：PKM2通过糖酵解-乳酸轴驱动SSc成纤维细胞活化，利用PKM2四聚化或阻断乳酸生成可能成为治疗选择有限的SSc的潜在策略。
