Sox5在齿状回发育过程中调控中间祖细胞的细胞周期进程

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Sox5 controls cell cycle progression in intermediate progenitor cells during dentate gyrus development

　　

齿状回（DG）的海马发育相较于其他脑区（如海马角或新皮层）在时间上更为持久，延伸至出生后最初几周。在DG出生后发育过程中，神经干细胞（NSCs）将持续生成成体神经发生龛，从而维持整个生命过程中颗粒神经元（GN）的产生。DG中的NSCs分裂产生中间祖细胞（IPCs），其自我更新或细胞周期退出决策的高度调控动态仍了解甚少。Sox5是一种转录因子（TF），对成体NSCs的建立至关重要，然而，其在DG发育过程中表达Sox5的IPCs中的潜在作用仍未被探索。在本研究中，研究人员证明，胚胎发育过程中Sox5的条件性缺失导致IPCs中细胞增殖和存活的严重改变。具体而言，Sox5缺失后，IPCs在出生后晚期和幼年成年阶段表现出S期时程缩短。此外，IPCs细胞周期动态的这些改变可能是观察到的Sox5缺陷小鼠中GN分化缺陷的基础，这些缺陷最终导致DG结构的细微形态学变化。最后，研究人员证明，额外缺失一个Sox6拷贝（一种与Sox5密切相关的TF）会导致比单纯Sox5缺失更严重的DG形态学破坏。总体而言，这些发现表明Sox5与Sox6协同在出生后DG发育过程中的IPC细胞周期进程和GN成熟中发挥重要作用。

**论文解读：Sox5与Sox6协同调控齿状回发育中中间祖细胞的细胞周期进程**

**研究背景与问题**

海马齿状回（DG）是大脑中一个独特的结构，其发育过程在出生后持续进行，与海马角（CA）或新皮层等脑区相比更为持久。在出生后发育过程中，DG中的神经干细胞（NSCs）不仅产生颗粒神经元（GNs）以构建成体神经发生龛，还在整个生命过程中维持GN的产生。NSCs分裂产生中间祖细胞（IPCs），IPCs经过有限次数的细胞分裂后分化成GNs。IPCs的自我更新与细胞周期退出之间的平衡对于DG正常形态和细胞数量的建立至关重要，但其调控机制尚不完全清楚。

目前已知多种转录因子（TFs）参与DG发育调控，如NeuroD1和Prox1对于GN的存活和分化至关重要，其缺失导致DG完全缺失；而COUP-TFI、Tbr2、Ngn2等因子的缺失则导致DG形态异常，但通常不涉及IPCs细胞周期动态的详细分析。Sox5（SoxD亚家族成员）已被证明对成体NSCs的建立至关重要，并在出生后DG发育中调控NSCs的静止期进入和深度。然而，Sox5在IPCs中的潜在作用，尤其是在细胞周期进程中的调控功能，尚未被探索。此外，其密切相关的蛋白Sox6在DG发育中的表达和功能也知之甚少。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明Sox5及Sox6在DG发育过程中对IPC细胞周期动态的调控作用。

**研究技术与方法**

研究人员利用以下关键技术方法开展研究：
1. **基因敲除小鼠模型**：采用Sox5^fl/fl和Sox6^fl/fl条件性敲除小鼠与Nestin-Cre转基因小鼠交配，生成神经特异性Sox5缺失（Sox5^null）、Sox6缺失（Sox6^null）以及Sox5完全缺失联合Sox6单倍剂量不足（Sox5^nullSox6^het）小鼠模型。
2. **胸腺嘧啶类似物脉冲标记**：通过腹腔注射BrdU、CldU和IdU，结合不同的时间点（1小时脉冲、24小时追踪、双标记法）标记S期细胞，分析细胞周期退出指数、S期时程和总细胞周期时程。
3. **免疫荧光染色与共聚焦显微镜**：使用多种细胞标记物（如Ki67、Tbr2、Sox2、Nestin、DCX、NeuN、Prox1、GFAP、Iba1等）进行免疫染色，结合共聚焦显微镜对DG切片进行定量分析，包括细胞计数、形态学测量（DG面积、叶片长度、颗粒细胞层宽度、角度等）。
4. **形态学分析**：采用Nissl染色和bisbenzimide染色评估DG整体形态，利用Fiji软件定量测量特定参数。
5. **统计方法**：采用双尾非配对Student’s t检验或双因素方差分析（Two-way ANOVA）进行组间比较。

**研究结果**

**1. Sox5缺失改变年轻成年小鼠的DG形态**
通过Nissl染色和bisbenzimide染色分析，研究人员发现Sox5^null小鼠在出生后第0天（P0）至P30期间DG面积无明显变化，但P30时出现特异的形态学改变：下叶（infrapyramidal blade）长度缩短（760.4 μm vs. 626.6 μm），上下叶间角度增大（52.67° vs. 38.91°），颗粒细胞层（GCL）厚度增加（45.35 μm vs. 59.86 μm）。这些结果表明Sox5发育性缺失导致年轻成年小鼠DG的细微形态学改变，提示可能存在NSCs和/或IPCs增殖及神经发生的异常。

**2. Sox5缺失影响出生后DG中的细胞增殖与存活**
研究人员利用Ki67标记分析增殖细胞，发现Sox5^null小鼠在P14时Ki67⁺细胞显著减少（35%降低），而P30时显著增加（约2.1倍）。通过bisbenzimide染色识别凋亡细胞核，发现P30时Sox5^null小鼠凋亡细胞数量显著减少（7.94 vs. 2.54 cells/section），且微胶质细胞（Iba1⁺）数量减少，但其吞噬效率未变。这些结果表明，Sox5缺失导致P30时DG细胞增殖增加和细胞死亡减少，共同导致GCL增厚。

**3. Sox5是DG发育中控制IPC数量所必需的**
研究人员分析了Tbr2⁺ IPCs的数量动态。在Sox5^null小鼠中，P5时Tbr2⁺细胞数与对照组相似，但P14时急剧减少44%（520.76 vs. 923.48 cells/section），而P30时增加36%（213.83 vs. 156.89 cells/section）。然而，IPCs的增殖分数（Ki67⁺Tbr2⁺/Tbr2⁺）在各时间点均无显著差异。这表明Sox5缺失导致IPC数量动态改变，但并非由IPC增殖分数变化引起。

**4. Sox5缺失导致DG出生后发育后期IPCs的S期缩短**
通过24小时BrdU脉冲追踪结合Ki67分析，研究人员发现Sox5^null小鼠IPCs（BrdU⁺Ki67^-Tbr2⁺）的细胞周期退出指数在P14和P30显著升高（P14: 34.51% vs. 60.10%; P30: 16.11% vs. 24.98%），表明细胞周期进程改变。进一步采用CldU/IdU双标记法，研究人员直接测量了P14时IPCs（Sox2⁺Nestin^-细胞）的S期时程，发现Sox5^null小鼠S期显著缩短（12.76 h vs. 8.33 h），而总细胞周期时程无显著差异。这表明Sox5在调控IPC S期长度中发挥关键作用。

**5. Sox5缺失损害新神经元的产生和分布**
研究人员分析DCX⁺未成熟神经元，发现Sox5^null小鼠P14时DCX⁺细胞减少，P30时增加。通过将DG分为四个等宽区域（bin）分析分布，发现P14时Sox5^null小鼠DCX⁺细胞更集中于靠近SGZ的区域（bin 4），而P30时异常分布于上层（bin 1和2）。此外，P30时Sox5^null小鼠中DCX⁺NeuN⁺双阳性细胞比例显著增加（8.81% vs. 28.81%），表明神经元成熟过程异常。这些结果提示Sox5缺失导致IPC S期缩短，进而影响新生神经元的正确迁移和成熟。

**6. Sox6缺失不影响DG神经祖细胞的增殖**
研究人员发现Sox6在发育DG中主要表达于NSCs和IPCs，并与Sox5高度共表达。然而，Sox6条件性缺失（Sox6^null）小鼠在P20时Ki67⁺和BrdU⁺细胞数量与对照组无显著差异，表明Sox6在DG发育中对神经祖细胞增殖并非必需。

**7. Sox5缺失小鼠中Sox6杂合缺失导致DG形态和NSC及IPC增殖的严重改变**
研究人员生成Sox5^nullSox6^het小鼠，发现其DG形态在P11和P30时出现严重异常。与Sox5^null和对照组相比，Sox5^nullSox6^het小鼠P11时Ki67⁺细胞显著减少（154.2 vs. 350.5 vs. 379.9 cells/section），Tbr2⁺ IPCs显著减少（333.3 vs. 698.3 vs. 788.8 cells/section），而NSC增殖（MCM2⁺GFAP⁺Sox2⁺）与Sox5^null相似。此外，P60时DCX⁺未成熟神经元数量显著增加（1220 vs. 631 vs. 438.6 cells/section）。这些结果表明Sox6与Sox5在DG发育中具有部分冗余和协同作用，尤其是在IPC生成和神经发生中。

**总结讨论**

研究结论部分指出：DG发育受严格调控，Sox5和Sox6是NSCs和IPCs中表达的转录因子，对NSCs的静止-激活动态至关重要。本研究发现，Sox5的胚胎缺失导致年轻成年小鼠DG出现细微但独特的形态学改变，部分源于IPC数量增加、GN生成增加和细胞死亡减少。Sox5缺失缩短了IPCs的S期时程，可能产生异常定位的未成熟神经元，并出现DCX与NeuN共表达。此外，Sox6与Sox5协同作用，共同调控早期出生后DG发育中IPCs的正确数量。这些数据表明，Sox5和Sox6作为阶段依赖性的神经祖细胞细胞周期动态调节因子，在神经发生级联的不同水平上发挥不同作用。在人类中，SOX5和SOX6突变是最近描述的罕见神经发育综合征的病因，因此揭示SoxD功能对于理解这些疾病的病理生理学至关重要。