HSP90抑制部分挽救强直性肌营养不良细胞模型中的选择性剪接失调

《Journal of Biological Chemistry》：HSP90 Inhibition Partially Rescues Alternative Splicing Dysregulation in Cell Models of Myotonic Dystrophy

　　

强直性肌营养不良1型（DM1）和2型（DM2）是由毒性扩增RNA表达引起的多系统疾病，这些RNA螯合肌肉盲样（MBNL）蛋白，导致广泛的选择性剪接失调。鉴于目前尚无针对DM的疾病修饰疗法，研究人员试图鉴定能够挽救潜在剪接失调的化合物。研究人员利用DM1患者来源的成纤维细胞开发了一种中通量剪接筛选平台，并用其对美国国立卫生研究院国家癌症研究所多样性集VI（NIH NCI Diversity Set VI）中的1584种化合物进行筛选，从而鉴定出macbecin II——一种HSP90抑制剂。Macbecin II介导的HSP90抑制纠正了DM1肌管中多个MBNL调控的剪接事件，而结构不同的HSP90抑制剂CCT018159也产生了类似效果。通过RT-PCR剪接分析、siRNA敲低、RT-qPCR、免疫印迹和RNA荧光原位杂交，研究人员检测了HSP90抑制在DM模型中的作用。HSP90抑制增加了MBNL1和MBNL2转录本水平，提高了MBNL2蛋白水平，并减少了DM1细胞模型中的毒性CUG和核焦点。对单个HSP90亚型的分析显示，敲低HSP90AA1、HSP90AB1和TRAP1可部分改善剪接缺陷，而敲低HSP90B1则加剧了剪接异常。研究人员还表明，使用HSP90抑制剂治疗可纠正DM2肌管中的剪接异常。这些数据共同将HSP90确定为DM中RNA毒性和选择性剪接的修饰因子，并支持进一步评估HSP90导向的治疗策略。

**论文解读：HSP90抑制部分挽救强直性肌营养不良细胞模型中的选择性剪接失调**

**研究背景与问题**
强直性肌营养不良（DM）是一种最常见的成人发病肌营养不良症，包括1型（DM1）和2型（DM2）两种亚型。DM1由DMPK基因3′非翻译区（UTR）中CTG重复序列扩增引起，DM2由CNBP基因内含子1中CCTG重复序列扩增引起。两种亚型均表现出重叠的多系统临床特征，包括进行性肌无力、肌强直、心脏传导障碍、认知障碍和胰岛素抵抗。其致病机制为毒性RNA介导的功能获得：扩增的重复RNA螯合肌肉盲样（MBNL）蛋白家族，形成核内焦点，导致MBNL蛋白功能丧失，进而引发广泛的选择性剪接失调。目前尚无针对DM的疾病修饰疗法，现有治疗手段（如反义寡核苷酸）面临全身递送、疗效和安全性等挑战。因此，鉴定能够挽救剪接失调的小分子化合物具有重要治疗意义。

**研究内容与结论**
研究人员开发了一种基于DM1患者来源成纤维细胞的中通量剪接筛选平台，利用该平台对NIH NCI多样性集VI中的1584种化合物进行筛选，鉴定出HSP90抑制剂macbecin II。Macbecin II在DM1肌管中剂量依赖性地挽救多个MBNL调控的剪接事件（如MBNL2外显子5、ATP2A1外显子22、NUMA1外显子16、SYNE1外显子137），且在不影响细胞活力的浓度范围内有效。结构不同的HSP90抑制剂CCT018159也产生类似效果，表明该效应源于HSP90抑制。机制研究表明，HSP90抑制增加MBNL1和MBNL2转录本水平，上调MBNL2蛋白，并减少DM1细胞模型中毒性CUG RNA和核焦点。通过siRNA敲低单个HSP90亚型（HSP90AA1、HSP90AB1、HSP90B1、TRAP1），发现敲低HSP90AA1、HSP90AB1或TRAP1可部分改善剪接，而敲低HSP90B1则加剧剪接异常，提示不同亚型具有非等效作用。此外，HSP90抑制在DM2肌管中也挽救剪接缺陷，并增加MBNL2蛋白水平。这些发现将HSP90确定为DM中RNA毒性和选择性剪接的修饰因子，支持进一步评估HSP90导向的治疗策略。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：
- 中通量剪接筛选平台：利用DM1患者来源成纤维细胞，以胰岛素受体（INSR）外显子11剪接为读出的RT-PCR分析。
- 化合物处理与siRNA敲低：使用NIH NCI多样性集VI化合物（1 μM）处理24小时，正对照槲皮素（64 μM），负对照DMSO；siRNA（20 nM）经INTERFERin转染试剂递送72小时。
- 剪接分析：RT-PCR结合Fragment Analyzer定量，计算百分比剪接变化（ΔPSI）。
- 基因表达分析：RT-qPCR（SYBR Green）检测MBNL1、MBNL2、HSP90亚型、DMPK mRNA，以GAPDH归一化。
- 蛋白分析：免疫印迹（MBNL1、MBNL2、pan-HSP90），考马斯亮蓝总蛋白归一化。
- RNA焦点检测：荧光原位杂交（FISH）使用Cy3-(CAG)₈探针，CellProfiler量化核焦点数量。
细胞来源：DM1患者成纤维细胞（Coriell GM4601）、DM1肌母细胞（UF DM04/DM05）、DM2肌母细胞（VCU中心），以及匹配的正常对照。

**研究结果**
**Development of a screening platform using a DM1 patient cell line for splicing rescue**
通过构建中通量剪接筛选平台，对1584种化合物进行筛选，以INSR外显子11剪接拯救为指标，设置ΔPSI >10为阈值，鉴定出8个初筛阳性化合物，其中macbecin II（HSP90抑制剂）表现出最佳剂量依赖性剪接拯救效果（1 μM达100%挽救），且无明显细胞毒性。

**Macbecin II rescues splicing in DM1 patient-derived myotubes**
在DM1患者来源肌管中，macbecin II（0.1–7 μM，48小时）剂量依赖性地挽救MBNL2外显子5、ATP2A1外显子22、NUMA1外显子16、SYNE1外显子137的剪接异常，最大拯救浓度7 μM。在正常肌管中，macbecin II仅引起较小剪接变化（<10% ΔPSI），且不影响非MBNL调控的剪接事件（CAMKK2外显子15、VTI1外显子5），表明效应具有MBNL依赖性。

**HSP90 inhibition by macbecin II modulates DMPK and MBNL transcript levels in DM1 myotubes**
Macbecin II处理DM1肌管增加总DMPK转录本水平，同时在DM1 HeLa细胞模型中减少毒性扩增r(CUG)₄₈₀ RNA丰度，但增加内源性DMPK mRNA。Macbecin II还显著增加MBNL1和MBNL2 mRNA，并显著上调MBNL2蛋白水平（MBNL1趋势性上升）。HSP90亚型表达分析显示，macbecin II处理导致HSP90AA1、HSP90AB1、HSP90B1代偿性上调，而TRAP1不变；HSP90蛋白水平也升高。相关性分析表明个别HSP90亚型mRNA与剪接拯救程度存在弱但可重复的相关性。

**Knockdown of individual HSP90 isoforms alters splicing and MBNL expression in DM1 cells**
siRNA敲低HSP90AA1、HSP90AB1、TRAP1（20 nM，72小时）在DM1肌母细胞和肌管中部分改善MBNL调控的剪接事件，而敲低HSP90B1加重剪接异常。敲低各亚型均引起其他亚型代偿性上调。在蛋白水平，敲低HSP90AA1和HSP90AB1增加MBNL1蛋白，MBNL2蛋白无显著变化，但TRAP1敲低降低MBNL2蛋白（尽管mRNA减少）。HSP90B1敲低降低MBNL1和MBNL2 mRNA但不影响蛋白水平。

**A structurally distinct HSP90 inhibitor also rescues splicing in a DM1 cell model**
CCT018159（N端HSP90抑制剂）处理DM1肌管96小时，显著拯救多个剪接事件（程度弱于macbecin II），增加DMPK mRNA，减少毒性r(CUG)₄₈₀ RNA，并选择性上调MBNL2 mRNA。等温滴定量热法（ITC）显示macbecin II与r(CUG)₄ RNA仅存在弱非特异性结合，排除直接RNA结合机制。

**HSP90 inhibition modulates RNA foci levels in DM1 cell models**
FISH分析显示，macbecin II和CCT018159处理DM1 HeLa细胞和患者来源肌管均显著减少核RNA焦点数量、焦点阳性核比例及含>2个焦点的核比例。

**HSP90 inhibition rescues mis-splicing in a DM2 cell model**
在DM2患者来源肌管中，macbecin II（48小时）和CCT018159（96小时）均显著拯救SYNE1外显子137和NUMA1外显子16的剪接异常，且macbecin II在2–4 μM浓度下无细胞毒性。Macbecin II处理增加MBNL1和MBNL2 mRNA，并仅上调MBNL2蛋白；CNBP转录本水平未受显著影响。

**总结与讨论**
本研究通过新型中通量剪接筛选平台鉴定出HSP90抑制剂macbecin II，证明其通过代偿性上调HSP90亚型、增加MBNL蛋白丰度（尤其是MBNL2）、减少毒性RNA焦点，部分挽救DM1和DM2细胞模型中的选择性剪接失调。研究排除了直接RNA结合机制，并验证了CCT018159的类似效应，表明HSP90抑制是共享的作用通路。讨论中指出，HSP90B1的敲低加重剪接异常，而HSP90AA1/AB1/TRAP1敲低改善剪接，提示不同亚型在DM1中具有非等效作用，可能涉及内质网应激等通路。此外，HSP90抑制对DM1和DM2的共性效应（MBNL2上调）支持其作为跨亚型治疗靶点的潜力。研究结论翻译如下：
**结论**：本研究将HSP90在DM中的作用扩展至调控选择性剪接，补充了近期关于DMPK转录本和RNA焦点水平的发现。通过结合药理学抑制和亚型特异性敲低，研究表明剪接拯救与HSP90亚型的代偿性上调相关，突出了细胞对HSP90抑制的响应主动参与剪接拯救。结合先前研究，本工作支持HSP90抑制增加MBNL丰度、部分纠正MBNL调控的剪接、减少毒性CUG RNA和核焦点。鉴于HSP90参与DM、亨廷顿病、脊髓延髓性肌萎缩等多种疾病的通路，HSP90通路有望成为未来治疗研究和开发的有前景靶点。