SLC17A9 (VNUT) 是否作为独立的核苷酸和/或磷酸盐转运体发挥作用

《Journal of Biological Chemistry》：Does SLC17A9 (VNUT) function as a stand-alone nucleotide and/or phosphate transporter?

　　

溶质载体SLC17A9先前被鉴定为一种囊泡核苷酸转运体，主要负责将ATP及相关核苷酸转运至细胞内囊泡中，其在小鼠中的缺失导致细胞内储存细胞器中的ATP丢失。研究人员利用重组SLC17A9和在脂质体中的功能重构，尝试表征其转运活性的分子特征。尽管纯化的蛋白包含完整的开放阅读框、形成二聚体，并且在脂质体中明显正确折叠和定向，但研究人员未能测量到任何核苷酸转运活性，尽管电化学势完整、脂质体无渗漏，且平行条件下重构的相关囊泡谷氨酸转运体（SLC17A5）具有活性。研究人员还测试了SLC17A9是否类似于SLC17家族的相关转运体，发挥Na⁺依赖性磷酸盐转运体功能。然而，未检测到此类活性，且在HeLa细胞中表达该转运体并未导致磷酸盐摄取的持续增加。研究人员得出结论：SLC17A9在囊泡核苷酸转运中的作用需要进一步证实，可能还需要额外迄今未知的因子。

**论文解读：SLC17A9 (VNUT) 的核苷酸与磷酸盐转运功能再评估**

**研究背景与问题**

三磷酸腺苷（ATP）不仅是细胞内能量供体，还作为细胞外信号分子通过激活嘌呤能受体发挥作用。ATP的释放途径之一是通过胞吐作用从细胞内储存囊泡中释放，这些囊泡通过液泡型H⁺-ATP酶（v-ATPase）产生的电化学质子梯度（ΔμH⁺）主动摄取ATP。2008年，Sawada等人鉴定出溶质载体超家族成员SLC17A9（也称为囊泡核苷酸转运体，VNUT）为负责ATP摄取的关键蛋白，其体外重构实验显示，人工膜电位（Δψ，内正）可驱动ATP转运。SLC17A9与囊泡谷氨酸转运体（VGLUTs，SLC17A6-8）结构相关，均依赖膜电位而非ΔpH，且被氯离子（Cl^-）激活，被偶氮染料、酮体及DIDS抑制。此外，双膦酸盐氯膦酸盐可特异性抑制其活性。转基因敲除小鼠研究表明，SLC17A9缺失导致多种细胞（如嗜铬细胞、β细胞、血小板、小胶质细胞等）的ATP释放消失，但小鼠无明显发育或代谢表型，仅近期研究显示星形胶质细胞条件性敲除导致焦虑样行为异常。然而，此前研究对SLC17A9的纯化蛋白在SDS-PAGE中表现出的表观分子量（60-80 kDa）与本研究存在差异，且其是否也像其他SLC17家族成员一样具有Na⁺依赖性磷酸盐（Pi）转运功能尚不清楚。因此，研究人员旨在进一步表征SLC17A9的生化与生物物理特性，特别关注其与VGLUT的异同，并验证其是否作为Na⁺依赖性Pi转运体。

**主要技术方法**

研究人员采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞（High5）中表达带有链霉亲和素结合肽（SBP）或双链霉亲和素标签（Twin-Strep-tag）的鼠源全长SLC17A9蛋白，经十二烷基麦芽糖苷（DDM）增溶、链霉亲和素亲和层析纯化，并通过SDS-PAGE、免疫印迹、质谱（LC-MS/MS）及尺寸排阻色谱（SEC）表征蛋白完整性。利用纯化的SLC17A9与细菌FoF1-ATP酶（TFoF1，来自嗜热芽孢杆菌）共同重构至脂质体（由DOPC、DOPS和胆固醇组成）中，通过动态光散射、负染电镜及STED显微镜验证重构效率。采用放射性标记的[3H]ATP、[3H]谷氨酸和[33P]磷酸检测转运活性，并利用Oxonol VI和吖啶橙染料监测膜电位（Δψ）和pH梯度（ΔpH）。此外，将SLC17A9瞬时转染至HeLa细胞（通过pIRES2-EGFP载体），通过免疫荧光和差速离心膜组分分析定位，并测定细胞对无机磷酸盐（Pi）的摄取。

**研究结果**

**1. 表达、纯化与初步表征**

纯化的SLC17A9蛋白在SDS-PAGE中显示为一条约40 kDa的主带，低于此前报道的60-80 kDa，但通过质谱分析覆盖了完整开放阅读框（包括N端和C端肽段），且在HeLa细胞中表达时也迁移至40 kDa，排除了截短或降解。SEC分析显示蛋白在DDM中洗脱为对称峰带肩峰，可能反映单体-二聚体平衡。蓝色非变性电泳表明，蛋白在不同去垢剂中迁移至80-200 kDa，提示形成二聚体甚至更高阶寡聚体。微尺度热泳（MST）实验测得的表观解离常数（KD）约为12 μM，进一步支持可逆二聚化。热变性实验显示蛋白在DDM、LMNG、GDN中保持正确折叠，熔化温度介于39.7°C至70.5°C。

**2. 重构人工囊泡后ATP摄取的表征**

将SLC17A9与TFoF1共重构至脂质体后，通过STED显微镜证实>80%的脂质体同时含有两种蛋白。TEV蛋白酶切割实验表明，大部分SLC17A9的N端标签暴露于脂质体外侧（与VGLUTs类似）。TFoF1激活后，脂质体可建立稳定的Δψ（内正，被FCCP消散）或ΔpH（通过缬氨霉素介导的K⁺外流实现），且ΔpH也可通过K⁺扩散电位生成。然而，在多种条件下（包括优化Δψ或ΔpH、改变脂质与蛋白比例、更换去垢剂、使用不同标签），均未检测到ΔμH⁺依赖性[3H]ATP摄取。在相同条件下重构的VGLUT1显示ΔμH⁺依赖性谷氨酸摄取，而嗜铬颗粒膜泡（chromaffin granule ghosts）显示FCCP敏感的ATP摄取，表明实验体系有效。此外，研究人员还开发了基于荧光ATP传感器（ATeam）的脂质体内腔检测方法，同样未观察到梯度依赖性ATP转运。

**3. SLC17A9是否作为无机磷酸盐（Pi）转运体？**

鉴于VGLUT1（SLC17A7）在质膜上可作为Na⁺依赖性Pi转运体，研究人员测试了SLC17A9是否具有类似功能。在HeLa细胞中瞬时表达SLC17A9（与eGFP共表达），免疫染色显示蛋白主要定位于细胞内囊泡，少量在质膜。Pi摄取实验显示，SLC17A9表达细胞与对照细胞相比，Pi含量无显著差异，仅对氯膦酸盐处理有轻微但一致的趋势。在脂质体重构实验中，通过建立由缬氨霉素介导的内负扩散电位（当外部Na⁺存在时，为Na⁺依赖性Pi摄取提供驱动力），未检测到Na⁺依赖性[33P]Pi转运。但氯膦酸盐可减少Pi滞留，提示蛋白可能结合Pi但不转运。

**讨论与结论**

研究人员在讨论中指出，尽管进行了大量实验和控制，仍无法重现此前Moriyama团队报道的SLC17A9对ATP的主动转运活性。可能的原因包括：纯化蛋白的表观分子量差异（本研究为40 kDa，过去为60-80 kDa，可能因去垢剂影响迁移行为或二聚体稳定化）、重构条件（如缬氨霉素浓度、脂质组分、分离方法）的差异，以及未知关键因子的缺失。此外，SLC17A9作为Na⁺依赖性Pi转运体的证据也不充分，可能因质膜定位比例低或脂质体取向问题。结论部分翻译如下：**研究人员得出结论，SLC17A9在囊泡核苷酸转运中的作用需要进一步证实，可能还需要额外迄今未知的因子。** 考虑到SLC17A9敲除仅导致轻微表型，且蛋白广泛分布于几乎所有组织，不能排除其功能涉及其他代谢物转运，或存在功能冗余的其他转运体，有待进一步研究。本研究发表在《Journal of Biological Chemistry》。