《Journal of Biological Chemistry》：IGSF3 drives acquired temozolomide resistance in glioblastoma through ASNS-dependent asparagine biosynthesis
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胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最具侵袭性的原发恶性肿瘤，替莫唑胺（TMZ）获得性耐药是导致复发和不良预后的关键因素。尽管MGMT（O6-methylguanine-DNA methyltransferase）介导的DNA修复已被广泛认可为TMZ耐药机制之
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最具侵袭性的原发恶性肿瘤，替莫唑胺（TMZ）获得性耐药是导致复发和不良预后的关键因素。尽管MGMT（O6-methylguanine-DNA methyltransferase）介导的DNA修复已被广泛认可为TMZ耐药机制之一，但在MGMT缺陷或低表达背景下，仍存在其他尚未阐明的耐药路径。研究人员整合耐药模型转录组、公共单核RNA测序数据及临床样本，筛选并验证出IGSF3在耐药和复发GBM中稳定上调，且主要富集于恶性胶质瘤细胞。功能研究表明，IGSF3通过核内转录激活ASNS（asparagine synthetase）启动子，促进ASNS表达与天冬酰胺（Asn）生成，降低治疗诱导的ROS（reactive oxygen species）积累，维持GSH/GSSG（reduced glutathione/oxidized glutathione）氧化还原平衡，并减少DNA损伤标志γH2AX（γH2AX）累积，从而驱动GBM获得性TMZ耐药。进一步地，Tucatinib可结合IGSF3并抑制IGSF3-ASNS轴，增强TMZ体内外疗效，提示该轴具有潜在治疗价值。
本文围绕胶质母细胞瘤（GBM）获得性替莫唑胺（TMZ）耐药展开。GBM是最具侵袭性的中枢神经系统原发恶性肿瘤，TMZ虽为标准一线化疗药物，但患者在初始应答后常发生耐药并最终复发，严重限制临床获益。既往研究已将MGMT介导的DNA修复视为重要耐药机制，但临床和实验上均提示，部分MGMT低表达或缺失模型仍可形成获得性耐药，说明还存在其他肿瘤内在驱动因素与代谢适应机制尚未被充分揭示。因此，阐明TMZ获得性耐药的分子基础，对于复发GBM的精准干预具有重要意义。
研究人员首先通过整合两套获得性耐药模型转录组数据，筛选出稳定一致变化的耐药相关基因，并结合功能富集分析、单核RNA测序和临床样本验证，锁定IGSF3为核心候选分子。结果显示，IGSF3在TMZ耐药细胞、耐药移植瘤及复发GBM组织中均明显升高，且主要表达于恶性胶质瘤细胞，而非微环境成分。功能实验进一步证明，IGSF3过表达可增强GBM细胞对MTIC（5-(3-methyltriazen-1-yl)-imidazole-4-carboxamide，TMZ活性代谢物）的耐受，敲低IGSF3则可恢复药物敏感性，并增加治疗诱导的DNA损伤。机制上，IGSF3并非仅作为膜蛋白发挥作用，其还能定位于细胞核并结合ASNS启动子，促进ASNS转录，从而增强Asn合成、减轻氧化应激并抑制γH2AX积累。进一步通过ASNS增益/缺失救援实验，确认ASNS是IGSF3促耐药效应所必需的下游效应分子。最后，Tucatinib被鉴定为可结合IGSF3的候选小分子，能够抑制IGSF3-ASNS通路并增强TMZ疗效。
该研究的重要意义在于：一是提出IGSF3-ASNS轴是GBM获得性TMZ耐药新的肿瘤内在代谢机制；二是将天冬酰胺生物合成与化疗耐受、氧化还原稳态及DNA损伤应答直接联系起来；三是为复发GBM提供了潜在药物再利用策略。论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。
主要技术方法包括：公开数据库与自建耐药模型转录组整合分析、单核RNA测序数据分析、临床组织IHC/IF验证、细胞药敏与克隆形成实验、异种移植瘤动物模型、RNA-seq与功能富集、ROS与GSH/GSSG检测、核质分离、双荧光素酶报告、ChIP-qPCR，以及SPR（surface plasmon resonance）和CETSA（cell thermal shift assay）用于验证Tucatinib与IGSF3的结合。样本来源包括GSE151680、GSE174554、CGGA队列、原发/复发GBM临床标本及U87来源的敏感/耐药模型。
结果部分显示，首先，Integrated transcriptomic screening identifies differentially expressed genes associated with acquired TMZ resistance。研究人员将自建U87耐药模型与GSE151680进行差异分析，得到51个一致改变基因；功能富集提示这些基因主要涉及炎症反应、细胞表面组分及免疫相关通路，说明获得性耐药伴随转录重编程。
其次，Selection and clinical validation of IGSF3 as a key candidate in acquired TMZ resistance。研究人员在上调基因中优先筛选候选分子，结合CGGA生存分析与蛋白水平验证，发现IGSF3在耐药模型中显著升高，并与较短总体生存相关；临床复发GBM中IGSF3也明显高于原发灶。
再次，Single-nucleus analysis reveals IGSF3 enrichment in glioma cells and its association with tumor recurrence。单核RNA测序显示IGSF3主要富集于恶性胶质瘤细胞，复发样本中IGSF3阳性肿瘤细胞比例更高，且该比例与较差生存显著相关，支持其为肿瘤内在耐药相关分子。
随后，IGSF3 modulates MTIC resistance and the cellular response to DNA damage in GBM cells。通过IGSF3过表达和敲低实验，研究人员证实其可分别增强或削弱细胞对MTIC的耐受；CCK-8、克隆形成和γH2AX检测均表明IGSF3可减轻治疗诱导的DNA损伤；体内移植瘤结果也证实其促进耐药。
接着，Transcriptomic profiling identifies IGSF3-regulated metabolic pathways and downstream effectors。RNA-seq显示IGSF3可广泛重塑转录谱，其共同下游基因富集于氨基酸生物合成及甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢，提示其通过代谢通路参与耐药适应。
然后，IGSF3 regulates ASNS expression as a key downstream effector in acquired TMZ resistance。PPI网络与验证实验进一步锁定ASNS为关键下游效应分子；ASNS在耐药细胞、耐药移植瘤和复发临床样本中均升高，且与IGSF3表达模式一致。
再者，ASNS-mediated asparagine biosynthesis is required for IGSF3-induced TMZ resistance。ASNS增减功能实验表明，ASNS本身可影响MTIC敏感性；救援实验显示，抑制ASNS可逆转IGSF3诱导的耐药，而恢复ASNS可重新建立耐药表型。机制上，ASNS通过提高Asn、降低ROS、维持GSH/GSSG平衡并减少γH2AX，从而缓冲治疗压力。研究人员还发现IGSF3可在细胞核中富集，增强ASNS启动子活性，并在ChIP-qPCR中显示其在ASNS启动子区域富集。
最后，Tucatinib engages IGSF3 and suppresses the IGSF3-ASNS axis to enhance MTIC sensitivity in resistant GBM cells。虚拟筛选、SPR和CETSA证明Tucatinib与IGSF3存在直接结合；该药物可抑制IGSF3和ASNS表达，降低Asn并扰乱氧化还原稳态，从而增强MTIC/TMZ敏感性，且在体内外均表现出联合增效作用。
讨论部分指出，本研究首次将IGSF3确立为GBM获得性TMZ耐药的肿瘤内在驱动因子，并揭示其通过核内调控ASNS启动子，激活Asn合成与氧化应激适应程序，最终降低治疗诱导DNA损伤信号。ASNS救援实验进一步证明该代谢轴对IGSF3促耐药效应是必需的。与此同时，Tucatinib作为可靶向IGSF3的候选小分子，为复发GBM的联合治疗提供了潜在思路。总体而言，研究明确了IGSF3-ASNS代谢轴在GBM化疗耐受中的关键作用，并提示其具有可干预的转化医学价值。
