《Journal of Biological Chemistry》：The N-terminal domain of the endoplasmic reticulum-resident chaperone Grp94 functions in aggregation prevention
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Grp94是定位于内质网（endoplasmic reticulum, ER）的Hsp90分子伴侣，通过核苷酸依赖的方式辅助蛋白质折叠与重折叠，在维持细胞蛋白稳态（proteostasis）中发挥核心作用。除折叠功能外，Grp94在应激条件下亦能抑制客户蛋白聚
Grp94是定位于内质网（endoplasmic reticulum, ER）的Hsp90分子伴侣，通过核苷酸依赖的方式辅助蛋白质折叠与重折叠，在维持细胞蛋白稳态（proteostasis）中发挥核心作用。除折叠功能外，Grp94在应激条件下亦能抑制客户蛋白聚集；然而该聚集抑制活性的机制基础尚未完全阐明。研究人员以柠檬酸合酶（citrate synthase, CS）和荧光素酶（luciferase）为模型客户蛋白，通过体外光散射与功能学实验，界定Grp94聚集抑制活性所需条件并定位其功能结构域。结果表明，Grp94抑制上述两种客户蛋白的热诱导聚集不依赖ATP结合、ATP水解及钙结合。值得注意的是，该聚集抑制活性定位于Grp94的N端结构域（NTD）；肽结合缺陷突变体H146D在分子伴侣限量条件下表现出增强的聚集抑制能力。此种增强效应归因于突变体对错误折叠客户蛋白亲和力的提升，可能源于客户解离速率的降低。因此，肽结合突变体抑制了客户从Grp94释放，进而损害下游BiP分子伴侣系统对客户的重塑。尽管Grp94的NTD是其聚集抑制的普遍要求，其pre-N结构域的参与则可能具有客户特异性。综上，本研究为Grp94的聚集抑制功能提供了新见解，并将既往鉴定的肽结合位点与聚集抑制活性相关联。
研究背景与立项依据：分子伴侣Hsp90家族通过ATP驱动的折叠循环与ATP非依赖的holdase（持留）活性共同维护蛋白稳态。Grp94作为内质网（ER）中Hsp90的旁系同源物，除协助胰岛素样生长因子（IGF）-II、整合素、Toll样受体等特定分泌/膜蛋白折叠成熟外，还被报道在严重应激时于BiP上游以ATP非依赖方式瞬时持留错误折叠蛋白于可溶状态，待应激解除后交由BiP系统重塑。然而Grp94哪一结构域执行聚集抑制、是否依赖核苷酸/钙、既有肽结合位点是否参与客户结合，此前结论冲突（有研究指C端结构域（CTD）主导，有指中段结构域（MD）主导，也有指NTD促聚集）。论文发表于《Journal of Biological Chemistry》，旨在以CS与luciferase为模型客户，通过体外光散射与功能重塑实验系统回答上述问题。
主要技术方法概述：研究采用纯化的人源Grp94全长及结构域截断体（NTD 23-288、MD 337-595、CTD 581-803）、pre-N缺失体（Δ72）及点突变体（D149N、E103A、H146D），样本均来自大肠杆菌BL21过表达体系。核心方法包括：固定角光散射（fixed-angle light scattering）监测热/化学变性CS与luciferase聚集动力学；动态光散射（dynamic light scattering, DLS）表征聚集体流体力学半径；荧光素酶重激活 assay 评估Grp94与BiP-DnaJB11-Grp170协同重塑；荧光偏振（fluorescence polarization）以FITC标记Δ131Δ K16C定量客户结合表观亲和力；圆二色与有限蛋白酶解佐证突变体折叠状态。忽略质粒构建与培养细节。
研究结果
全长度Grp94以浓度依赖方式抑制化学与热变性柠檬酸合酶的聚集：固定角光散射显示，热变性CS（45℃）或化学变性CS（6 M Gdn-HCl稀释）在缺乏分子伴侣时形成大聚集体（流体力学半径300-400 nm），加入Grp94后光散射平台值下降，DLS证实聚集体被截留于Grp94复合物尺寸（~6 nm）；CS活性 assay 提示Grp94持留客户于可部分重激活中间态。因化学变性聚集过快，后续聚焦热变性模型。
Grp94的聚集抑制不要求钙结合、ATP结合或水解：补加Ca2+、EGTA、ATP或AMP-PNP（非水解ATP类似物）均不改变抑制曲线；ATP结合缺陷体D149N与水解缺陷体E103A在亚计量浓度下甚至略优；AMP-PNP诱导的闭合构象未见显著增强。结论：holdase式聚集抑制是核苷酸/钙非依赖、构象非特异的。
Grp94的N端结构域与客户相互作用抑制聚集：孤立NTD（自身因pre-N柔性呈寡聚，流体半径5-6 nm）在等量单体浓度下抑制CS与luciferase聚集的效果与全长二聚体相当；MD与CTD无抑制力，DLS显示其被募集入客户聚集体而非持留可溶态。换用luciferase复现结论。NTD单独足以holdase但不足以支持BiP系统下游重激活（重激活率降约2.5倍，即使NTD过量6倍亦然），说明全长多结构域协作对释放-重塑步骤必需。
Grp94的肽结合区参与聚集抑制：基于既往定位H146为肽结合关键残基，构建H146D。该突变体折叠近似野生型，但在低分子伴侣/客户比时CS聚集抑制显著强于野生型（平台值更低），luciferase趋势同；荧光偏振显示H146D对Δ131Δ K16C表观亲和力约高6倍。在holdase-first途径中，H146D因解离慢、释放少，使BiP介导luciferase重激活降低1.5倍；在active-foldase途径（Grp94与BiP共变性）中，H146D不仅消除野生型增益，还低于BiP单独组，表现与D149N类似的高亲和动力学陷阱。
pre-N结构域呈客户特异性：缺失pre-N（Δ72）对CS抑制略降（不显著），对luciferase在亚计量时反而增强。结合既往myocilin研究中pre-N/K140交联促聚集的报道，研究人员指出pre-N与NTD（K140、H146所在表面）的客户端互作具有底物依赖性，非聚集抑制普适要件。
讨论与结论翻译：Hsp90家族具经典holdase属性，本研究将Grp94该活性定域于NTD，并证明不依赖ATP/钙/特定闭合构象。H146D增强holdase但损害释放，说明肽结合区（H146所在疏水裂槽）可直接接触错误折叠客户，或经变构降低解离速率；此与D149N经ATP-lid构象陷阱增效的机制不同，但在阻滞BiP重塑上殊途同归。NTD单独持留易形成稍大可溶复合物，暗示全长MD/CTD在屏蔽非特异互作与计量释放上有补位功能。Grp94对myocilin等病理客体的促聚集属底物依赖例外，非野生型对模型客体的常态。NTD同时承担抗原提呈中的肽结合模块，凸显同一结构单元在蛋白稳态与免疫交叉中的多重角色。综上：Grp94的NTD是其ATP/钙非依赖聚集抑制的核心执行者，既往肽结合位点H146参与错误折叠客户 engagement；H146D式高亲和突变虽强化holdase却因阻碍客户释放而破坏BiP下游重塑；pre-N贡献随客户而异。该研究厘清了Grp94结构域分工，为靶向NTD肽结合面的选择性调节剂设计提供概念框架。
