JIP3和JIP4适配蛋白解除kinesin-1马达自抑制形式的机制解析

《Journal of Biological Chemistry》：Insights into how JIP3 and JIP4 adaptor proteins relieve the auto-inhibited form of the kinesin-1 motor

　　

尽管我们对kinesin自抑制机理的理解正在深入，但关于kinesin激活的关键见解，特别是由货物-马达适配蛋白解除自抑制的机制，仍不清楚。JIP3和JIP4是适配蛋白，可激活kinesin-1和dynein-dynactin马达，实现沿微管的双向运输。在此，研究人员利用诱变和结合实验结合建模，表征了kinesin-1重链KIF5B与JIP3和JIP4（JIP3/4）之间的相互作用。研究人员确定了JIP3/4和KIF5B相互作用所需的最小区域。JIP3/4与KIF5B的CC4卷曲螺旋结构域结合，未检测到与远端尾部的显著相互作用。相反，KIF5B-CC4与JIP3/4的RH1结构域结合，其上游的无序N端调节结合强度。值得注意的是，JIP3和JIP4对KIF5B的亲和力差异约40倍。研究人员对JIP3/JIP4的KIF5B结合区域进行了广泛的定点诱变，靶向可及的带电残基以及JIP3和JIP4之间的序列差异。这揭示了多个弱亲和力结合位点，这些位点共同在JIP3的RH1结构域上定义了一个广泛的KIF5B结合面。重要的是，JIP3上的KIF5B结合面不同于DLIC（dynein轻中间链）的结合面，证实两个马达之间不存在竞争。总之，本研究呈现的KIF5B与JIP3和JIP4结合的片段和突变图谱，揭示了kinesin-1的自抑制形式如何可能被解除，其中CC4区域发挥核心作用。

**论文解读：JIP3和JIP4适配蛋白解除kinesin-1马达自抑制的分子机制**

**研究背景**
Kinesin-1是一种重要的微管马达蛋白，负责细胞内货物（如囊泡、细胞器）的顺行运输。在非活性状态下，kinesin-1通过其重链（KHC）的C末端尾部与近端茎部（stalk）的相互作用，形成一种紧凑的自抑制构象，从而阻止ATP水解和微管结合。这种自抑制状态的解除是kinesin-1激活和启动运输的关键步骤。货物-马达适配蛋白，如JIP3和JIP4（JIP3/4），在招募和激活马达方面发挥着核心作用。JIP3/4不仅能招募kinesin-1，还能同时招募dynein-dynactin复合物，从而实现沿微管的双向运输。尽管对kinesin-1自抑制的结构基础已有一定了解，但JIP3/4适配蛋白如何具体识别并结合kinesin-1重链（KHC），进而解除其自抑制状态，其分子细节仍不清楚。特别是JIP3和JIP4这两个旁系同源物在结合KHC上的差异及其对马达激活的调控意义，尚待阐明。因此，阐明JIP3/4与KHC相互作用的分子基础，对于理解kinesin-1的激活机制至关重要。

**研究内容与结论**
研究人员对JIP3和JIP4（JIP3/4）适配蛋白如何与kinesin-1重链KIF5B相互作用，并最终解除其自抑制状态进行了深入研究。通过使用微尺度热泳（MST）技术、定点诱变、嵌合体构建和AlphaFold2建模等多种方法，研究人员精确定位了相互作用的最小区域，揭示了JIP3和JIP4在结合KIF5B上的显著差异，并绘制了KIF5B在JIP3上的结合表面。该研究发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

**主要技术方法**
研究人员采用了微尺度热泳（MST）技术定量测定不同蛋白质片段、嵌合体和突变体之间的结合亲和力（Kd值）。为确定最小结合区域，他们构建了一系列KIF5B尾部区域和JIP3/4 N端区域的截短片段，并利用圆二色光谱（CD）和多角度光散射（MALS）验证了这些片段的结构完整性。为定位关键结合位点，研究人员对JIP3/4进行了定点诱变，将选定的带电或极性残基突变为丙氨酸。此外，他们还利用AlphaFold2-Multimer进行结构预测，以探讨相互作用界面的可能构象。所有蛋白质均在**大肠杆菌（Escherichia coli）**中重组表达。

**研究结果**

**1. KIF5B尾部区域和JIP3/4 N端片段的特征**
研究人员设计了KIF5B尾部区域的四个片段（CC3b-CC4-dt, CC3b-CC4, CC4, dt）和JIP3/4 N端区域的四个片段（N-RH1-LZI, RH1-LZI, N-RH1-lz3, RH1-lz3）。CD和MALS分析证实，所有KIF5B尾部片段和JIP3/4 N端片段均具有预期的结构完整性，适合进行结合实验。KIF5B的CC3b-CC4区域形成良好的卷曲螺旋，而远端尾部（dt）为无序结构。JIP3/4的RH1-lz3片段足以形成稳定的二聚体。

**2. JIP3与KHC结合区域的定位**
通过MST分析，研究人员确定了KIF5B的CC4区域和JIP3的RH1-lz3区域是相互作用的最小区域。KIF5B-CC3b-CC4-dt片段与JIP3-N-RH1-LZI片段的结合解离常数（Kd）为18.8 ± 4 nM。JIP3的N端无序区域和KIF5B的远端尾部（dt）均能调节该相互作用的强度，去除它们会降低亲和力。通过对JIP3 RH1结构域上的带电残基（如Glu27, Glu39, Glu41, Glu54, Arg38, Arg42）进行丙氨酸扫描诱变，研究人员发现没有单个残基构成结合的热点，但多个酸性残基（Glu）的突变会略微降低亲和力，表明这是一个由多个弱亲和力位点共同构成的广泛静电相互作用界面。

**3. JIP3和JIP4与KIF5B结合亲和力的差异**
MST实验发现，KIF5B与JIP4的结合亲和力（Kd = 777.2 nM）显著弱于与JIP3的结合（Kd = 20.6 nM），相差约37.7倍。与JIP3不同，JIP4的N端区域不影响其与KIF5B的结合。通过序列比对和嵌合体/突变体分析，研究人员确定了四个关键位点导致此差异：
1. JIP3的N端无序区域。
2. RH1结构域顶端的His45-Cys46残基。
3. 靠近RH1顶端的酸性残基簇（Glu39, Glu41, Glu54）。
4. 靠近LZI的第二个酸性残基簇（Glu27, Glu72, Glu77）。
其中，His45和Cys46的差异（在JIP4中为Gly和Arg）对亲和力差异贡献最大（9.6倍）。然而，单独的突变或嵌合体无法完全解释37.7倍的差异，说明多个位点的协同效应是导致JIP3和JIP4亲和力差异的原因。

**4. JIP3/4与KIF5B界面的综述**
由于卷曲螺旋相互作用的复杂性，研究人员未能通过X射线晶体学或AlphaFold2获得JIP3/4:KIF5B复合物的可靠3D结构。MST结合数据表明，JIP3上的KIF5B结合面是一个延伸的、主要带负电的表面，从RH1结构域的顶端延伸到LZI的起始端。该结合面与dynein轻中间链（DLIC）在JIP3上的结合位点（位于同一单体α1和α2螺旋之间的疏水口袋）不重叠，从而证实了JIP3/4可以同时结合两种马达蛋白而互不竞争。

**5. KIF5B的CC4区域优先招募卷曲螺旋伙伴**
KIF5B的CC4区域是多个蛋白质的结合位点，包括JIP3/4、SNARE蛋白、Milton/TRAK等。对已知相互作用伙伴的分析表明，它们与CC4结合的区域通常具有螺旋或卷曲螺旋构象、内含无序区域，且等电点偏酸性。这表明卷曲螺旋结构是CC4结合的一种常见模式，这与kinesin-1自抑制构象中CC1与CC4相互作用的现象一致。

**6. JIP3/4如何解除KHC的自抑制形式**
基于最新的kinesin-1自抑制结构模型，研究人员提出，JIP3/4的N端区域（N-RH1-lz3）通过高亲和力结合KIF5B的CC4区域，能够直接竞争性地破坏CC4与CC1卷曲螺旋以及马达结构域之间的分子内相互作用，从而释放CC4，打破自抑制构象（图7）。在存在KLC的情况下，JIP3/4还可以通过其LZII结构与KLC的TPR结构域相互作用，这可能进一步释放CC4和TPR，为kinesin-1的完全激活创造条件。

**讨论与结论**
本研究中，研究人员对JIP3和JIP4与KIF5B结合的分子基础进行了表征，为理解KHC如何被这些货物-马达适配蛋白招募提供了新的见解。研究数据表明，KIF5B-CC4通过其无序的N端和RH1结构域招募JIP3/4的N端区域。在该区域内，未发现与KIF5B相互作用的单个热点残基；相反，研究人员绘制了一个延伸的、主要带负电的、参与KIF5B结合的表面。此结合面从RH1结构域的顶端延伸至LZI的起始端，且N端可以调节与KIF5B的相互作用。因此，JIP3与KHC的结合模式（Kd在纳摩尔范围）并非由单个热点相互作用介导，如JIP3与DLIC（Kd在微摩尔范围）的结合那样；相反，它涉及多位点相互作用，其中无序的N端、RH1结构域的顶端以及位于不同单体α1和α2螺旋之间的酸性残基簇协同作用。这种复杂性可能解释了为何难以获得JIP3-KHC复合物的可靠模型，这与通常与卷曲螺旋相互作用相关的挑战是一致的。