《Journal of Biotechnology》：Construction and systematic engineering of
Saccharomyces cerevisiae for efficient
de novo biosynthesis of pentostatin
编辑推荐：
•在酿酒酵母中实现了戊糖酯酶的从头合成，其浓度可达16.28毫克/升。•敲除AAH1基因并整合rDNA可协同提升前体物质的供应量。•通过FBA引导的cns4表达可减轻毒性并提高路径产出效率。• docking分析发现cns4中存在一个可用于捕获戊糖酯酶靶标的跨结构域腔体。•转录组
- •
在酿酒酵母中实现了戊糖酯酶的从头合成，其浓度可达16.28毫克/升。
- •
敲除AAH1基因并整合rDNA可协同提升前体物质的供应量。
- •
通过FBA引导的cns4表达可减轻毒性并提高路径产出效率。
- •
docking分析发现cns4中存在一个可用于捕获戊糖酯酶靶标的跨结构域腔体。
- •
转录组分析表明cns4能重新调控全球碳流，使其更倾向于PPP途径。
引言
戊糖酯酶是一种强效的腺苷脱氨酶抑制剂，由于其高选择性和强大的抗肿瘤活性，已成为治疗毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病以及某些T细胞淋巴瘤的一线临床药物（Schroeder等人，2026年）。除了在肿瘤学领域的应用外，它作为免疫抑制剂在器官移植和抗病毒治疗中也展现出良好的应用前景（Margolis和Vogelsang，2000年）。鉴于其临床需求不断增加，亟需开发一种可持续、环保且成本较低的制造方法。
然而，目前用于生产戊糖酯酶的方法存在诸多缺陷。化学合成法需要经过多个保护-去保护步骤，还存在手性分离困难以及整体产率极低的问题，这使得该方法不仅对环境不友好，而且在大规模生产中也不具备经济可行性（Song等人，2021年）。传统的生产方式依赖于军虫或链霉菌菌株的天然发酵（Xia等人，2017年；Liu等人，2024年；Wu等人，2017年），但这些方法存在生长缓慢、发酵条件苛刻、副产物复杂、产量低以及生产周期长（通常超过7天）等弊端。尽管在改造能够产生目标酶的天然菌株方面已取得一定进展（Zhang等人，2023年），但这些天然菌株仍存在生长速度慢、发酵条件严格、产物组成复杂以及产率不稳定等问题，难以满足日益增长的市场需求。
酿酒酵母作为一种被认定为安全的真核生物表达系统（Wang等人，2025年），在异源生产核苷类天然产物方面具有独特优势（Borodina和Nielsen，2014年；Fu等人，2024年）。与大肠杆菌等原核生物相比，酵母拥有完整的内质网-高尔基体分泌系统、强大的翻译后修饰机制（Qin等人，2021年），并且与真核酶的兼容性更好（Li等人，2021年）。更为重要的是，酵母具有功能明确的天然嘌呤代谢途径和磷酸戊糖途径（PPP）（Takaine等人，2025年；Zhang等人，2025年），这些途径能够持续供应戊糖酯酶生物合成所需的关键前体物质5-磷酸核糖-α-1-焦磷酸（PRPP）（Shiraishi和Kuzuyama，2019年）。随着从军虫中鉴定出戊糖酯酶核心骨架合成酶基因cns3（Xia等人，2017年），在酵母中构建从头合成的戊糖酯酶生物合成途径在技术上已经成为可能。
尽管有这些优势，但要构建高效的戊糖酯酶生产酵母细胞工厂仍面临若干固有的瓶颈（见图1）。首先，天然的嘌呤代谢网络会与腺嘌呤和PRPP等关键前体物质激烈竞争（Nielsen，2017年；Ouyang等人，2025年），从而严重限制了用于戊糖酯酶合成的碳流。尤其是内源性的腺嘌呤氨基水解酶Aah1会催化腺嘌呤的脱氨基反应，这不仅会减少前体物质的可用量，还可能破坏最终产物（Koz'min等人，1997年）。其次，作为具有生物活性的核苷类似物，戊糖酯酶在细胞内的积累会产生显著的细胞毒性，抑制细胞生长并降低产物产量。第三，目前尚未发现专门用于转运戊糖酯酶的转运蛋白，导致其排出效率低下，进一步加剧了产品的毒性并降低了路径的效率。虽然系统生物学工具如全基因组规模代谢模型（GEMs）（Orth等人，2010年）和通量平衡分析（FBA）已被广泛用于预测代谢瓶颈（Jiang等人，2021年；Lu等人，2019年），但针对核苷类天然产物的转运蛋白工程研究仍然相对较少，这主要是因为目前还缺乏关于底物识别和空间排出机制的原子级理解（Zhang等人，2016年）。
为了解决这些难题，我们采用了一种系统化的自下而上策略来开发高效生产戊糖酯酶的酵母细胞工厂。我们首先通过表达核心基因cns3实现了戊糖酯酶的从头合成，随后通过启动子工程和多拷贝rDNA整合提升了基因的表达强度和遗传稳定性。接着，我们通过敲除具有竞争关系的AAH1基因来重新引导代谢流，从而显著增加了前体物质的供应量。在FBA模拟的指导下，我们引入了来自军虫的预测转运蛋白Cns4，该转运蛋白有效降低了细胞内产品的毒性，并大幅缩短了发酵周期。此外，为了解明这种高效排出的分子机制，我们进行了计算机模拟的拓扑分析及分子对接研究，发现存在一种由特定的跨结构域结合腔体驱动的独特细胞内捕获机制（Jumper等人，2021年）。最后，通过比较转录组分析结合代谢流分析，我们揭示了提升生产性能的全球调控机制，结果表明Cns4不仅具有转运泵的功能，还能重新调控核心的碳代谢、PPP途径以及能量代谢，从而提升生产效率。
本研究在异源表达系统中实现了迄今为止报道的最高浓度的戊糖酯酶，同时提供了一种可扩展且适合工业化应用的生物制造平台。更广泛而言，它也为通过结合代谢工程、转运蛋白工程以及系统生物学方法来优化有毒核苷类天然产物的生物合成提供了可借鉴的策略。
章节要点
2.1 质粒构建与转化
我们使用大肠杆菌DH5α作为质粒复制载体，而酿酒酵母W303-1A菌株则用于戊糖酯酶的表达。表达载体选用pYES2，克隆载体则选用pUC19。对于大肠杆菌和酿酒酵母的转化，分别采用了化学转化法和醋酸锂转化法。本研究使用的所有菌株、质粒以及引物分别列于表S1、表S2和表S3中。
戊糖酯酶异源生物合成途径的初步构建与启动子优化
为了在酿酒酵母中实现戊糖酯酶的从头合成，我们首先从军虫中克隆出了编码负责构建戊糖酯酶骨架的关键酶的核心生物合成基因cns3。我们构建了半乳糖诱导型表达质粒pYES2-GAL1-p-cns3-CYC1t（见图2A），并将其转入底盘菌株W303-1A中，从而得到了初始的生产菌株W303-G-C3。
为了进行定量生产分析，我们建立了基于真实戊糖酯酶的HPLC分析方法
结论
在本研究中，我们通过组合型的代谢工程策略，对酿酒酵母进行了系统改造，以实现抗肿瘤核苷类药物戊糖酯酶的高效异源生物合成。我们从最初基于半乳糖诱导的核心生物合成基因cns3的表达开始，首先用强效的组成型TDH3启动子替换了受葡萄糖抑制的GAL1启动子，这样就可以仅以葡萄糖作为唯一碳源来实现高效生产，无需使用昂贵的诱导剂。之后我们
CRediT作者贡献说明
刘志毅：资源提供、方法设计、实验实施。白明哲：初稿撰写、实验实施、正式分析、数据整理。陈玉娇：资源提供。王超忠：初稿撰写、正式分析、数据整理。陆俊：审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、概念构思。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了重庆市自然科学基金（CSTB2023NSCQ-MSX0943）、西南大学2035创新研究计划重点项目（SWU-XDZD22007）以及重庆市和西南大学“聚才计划”（SWU116068）的支持。同时，我们感谢BioRender.com为我们提供本研究中所使用的科学绘图工具。
Mingzhe Bai|Zhiyi Liu|Chaozhong Wang|Yujiao Chen|Jun Lu
