宽带腔增强吸收光谱（BBCEAS）作为HPLC检测器在250–400 nm紫外波长范围的新应用

《Journal of Chromatography A》：Novel applications of Broadband Cavity Enhanced Absorption Spectroscopy (BBCEAS) as a detector for HPLC at ultraviolet wavelengths from 250 - 400 nm

　　

首次在250–400 nm紫外（UV）范围内将宽带腔增强吸收光谱（BBCEAS）作为高效液相色谱（HPLC）检测器进行应用。与传统HPLC-UV吸收检测相比，灵敏度提升最高达25倍。在近紫外区实现了多环芳烃（PAHs）的宽带多路检测，并展示了维生素D₂和D₃在深紫外区的检测能力。该方法提供了一种简单、低成本的腔增强替代UV检测方案。

**研究背景与问题**
高效液相色谱（HPLC）是分离和检测液相混合物中化合物的广泛应用技术，其中常规紫外-可见吸收检测器因其简单、通用和低成本而最为常见。然而，单次通过式的吸收检测器受限于标准HPLC流动池的短光程（通常1 cm），导致对弱吸收或痕量分析物的灵敏度较差，远低于荧光检测器或质谱仪。为提升基于吸收的HPLC检测灵敏度，同时保持光学吸收测量的简单性和广泛适用性，研究人员尝试了基于光学腔的吸收光谱技术，如腔衰荡光谱（CRDS）和腔增强吸收光谱（CEAS）。这些技术通过延长有效光程来提高灵敏度，但以往用于液相色谱的CRDS系统多依赖脉冲激光、单波长操作和复杂光学对准，限制了光谱信息和多路复用能力。宽带腔增强吸收光谱（BBCEAS）结合宽带照明和光谱仪检测，无需时间分辨衰荡测量，系统更简单、成本更低，但此前仅被演示为HPLC检测器用于可见光区（450–600 nm），而许多化学、生物和药物分析物在紫外区（200–400 nm）有强吸收，特别是在深紫外区（<300 nm）光学损耗增加、镜面反射率降低，BBCEAS在该波段的HPLC检测尚未被报道。因此，研究人员旨在首次将BBCEAS作为HPLC检测器应用于250–400 nm紫外波长，以评估其宽带、多路复用和增强灵敏度的能力，并选择环境相关的多环芳烃（PAHs）蒽和芘以及营养重要的维生素D₂和D₃作为模型分析物。该论文发表在《Journal of Chromatography A》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用了自制的HPLC-BBCEAS系统，其关键核心技术包括：使用激光驱动光源（LDLS）或高功率紫外LED（280 nm，30 mW）作为宽带光源；两组高反射率镜片（近紫外组R≥99%±0.3%，范围310–430 nm；深紫外组R~96%，范围250–400 nm）构成10 cm光学腔；将标准HPLC流动池（Hellma Analytics，德国，光程1 cm，体积80 μL，孔径3 mm）置于腔中心；通过光谱仪（AvaSpec-2048XL-USB2紫外-可见光谱仪，Avantes，荷兰）检测腔后光强，并由PC记录数据。样本来源：蒽和芘购自Sigma-Aldrich，英国；维生素D₂和D₃购自Sigma-Aldrich，英国。

**研究结果**
**近紫外区（300–400 nm）的测量结果**
通过HPLC-BBCEAS系统在338 nm（蒽）和333 nm（芘）分别进行测量，蒽的腔增强因子（CEF）为29.5±0.13，芘的CEF为30.1±0.12；在356 nm（蒽的更大吸收峰）处CEF提升至42.3±0.15。灵敏度α_min(t)分别为9.8×10^-6 cm^-1 Hz^-?（蒽，338 nm）、9.6×10^-6 cm^-1 Hz^-?（芘，333 nm）和6.8×10^-6 cm^-1 Hz^-?（蒽，356 nm），比传统Perkin-Elmer HPLC系统的灵敏度提高约25倍（蒽）和18倍（芘）。检测限（LOD）比较表明，光谱法（LOD_SM）比线性回归法（LOD_LRM）低10倍以上，且BBCEAS的LOD_SM值比传统系统低43–48倍。混合物色谱图显示，在335 nm处可分离并检测浓度为0.01 mg/L的蒽和芘，而传统系统在0.1 mg/L时已无法检测。

**深紫外区（250–300 nm）的测量结果**
在282 nm处测量维生素D₂和D₃。使用LDLS光源时，CEF为11.5±0.3（D₂）和14.6±0.7（D₃），但灵敏度α_min(t)（5.1×10^-4和4.0×10^-4 cm^-1 Hz^-?）比传统系统差约3倍，原因是LDLS在~280 nm处光子通量低导致基线噪声增大。使用LED光源时，CEF为7.6±0.3（D₂）和10.0±0.3（D₃），但灵敏度α_min(t)（7.7×10^-5和5.8×10^-5 cm^-1 Hz^-?）比传统系统提高约3倍。LOD_SM值：LED光源下，维生素D₂和D₃的LOD_SM分别比传统系统低约3倍，且比LOD_LRM低5–7倍。混合物分离显示，在282 nm处可检测至1 mg/L浓度，且LED光源的色谱图比LDLS更平滑。

**讨论与结论**
讨论部分指出，近紫外区CEF值低于可见光区BBCEAS研究，主要归因于紫外光在流动池表面和溶剂中的散射与吸收损耗，以及所用波长处镜面反射率较低。在356 nm处CEF值提升，与镜面反射率更高一致。基线噪声在BBCEAS与传统系统间相近，灵敏度提升主要来自有效光程增加。深紫外区，LDLS的低光子通量导致噪声增大，尽管CEF为11–15，但灵敏度仍不如传统系统；而LED光源的高光子通量使基线噪声更接近传统系统，结合腔增强，实现了3倍灵敏度提升，且比先前CRDS研究（273 nm）灵敏17倍。LOD比较表明，光谱法更准确反映了BBCEAS系统的真实检测限。结论部分翻译：本研究首次展示了HPLC-BBCEAS检测系统在紫外波长的应用。它报告了在近紫外区（300–400 nm）首次使用简单低成本装置（LDLS光源）的HPLC-BBCEAS技术，结果显示出较先前CRDS和BBCEAS研究更好的灵敏度，以及比传统Perkin-Elmer HPLC仪器显著提高的灵敏度。此外，本研究还表明，将BBCEAS作为HPLC检测系统用于深紫外区是可能的，具有高灵敏度、简单性和低成本。未来工作可通过光纤耦合光源减少近紫外对准和准直损耗，并在高反射率镜片最大反射率波长处进行测量；在深紫外区，可通过耦合更强功率的深紫外光源与更高反射率（R≥0.99%）的深紫外镜片及更灵敏的光谱仪进一步提高灵敏度。