转氨酶催化5-羟甲基糠醛转氨反应的放大系统评价

《ChemCatChem》：Systematic Evaluation for Upscaling of the Transaminase-Catalyzed Transamination of 5-(Hydroxymethyl)Furfural

　　

伯胺的生产是一个备受关注的课题，因为这些分子被认为是药物和精细化学品的构建模块。因此，从生物基5-（羟甲基）糠醛（HMF）酶法合成5-羟甲基-2-糠胺（HMFA）具有重要意义，因为呋喃类化合物是重要的构建模块并可来自可再生资源。在本研究中，来自Silicibacter pomeroyi的胺转氨酶（SpATA）被用作可溶性和固定化催化剂（固定于戊二醛功能化的HA-beads（HAGA-beads）上），以分析和改进HMFA的合成。对于可溶性酶，HMF浓度提高到900?mm，对于固定化酶提高到150?mm，实现了几乎完全转化。此外，研究人员评估了不同摩尔过量的胺供体单异丙胺（MIPA）或L-丙氨酸（1倍–100倍），以实现高效的HMFA合成并避免不必要的高浓度。最后，该反应被放大至200?mL规模，使用SpinChem旋转床反应器，在第一个循环中达到93%的转化率，48?h内生产了2.34?g HMFA，在总共五个循环中生产了7?g HMFA。

**论文解读：转氨酶催化5-羟甲基糠醛转氨反应的放大系统评价**

**研究背景与问题**

5-羟甲基糠醛（HMF）是一种重要的生物基平台化合物，可通过酸催化脱水己糖（如葡萄糖、果糖）获得，其结构中含有醛基和羟基，可进一步转化为多种呋喃衍生物，如2,5-二甲基呋喃（DMF）作为生物燃料，或2,5-二甲酰呋喃（DFF）和2,5-二羟甲基呋喃（BHMF）作为生物聚合物单体。将HMF胺化得到5-羟甲基-2-糠胺（HMFA）可引入胺官能团，该产物是合成防腐剂、抗高血压药和利尿剂等药物中间体的关键前体。然而，化学催化方法（如使用钴、镍、钌等金属催化剂）通常在80–130?°C高温、2–4?MPa氢压下进行，且使用二氧六环、甲醇或氨等有害溶剂，这与绿色化学理念相悖，且易生成副产物混合物，降低目标胺的产率。此外，HMF浓度较高时，反应物分离困难，需使用保护基团（如叔丁氧羰基酐，Boc₂O）。

为克服上述挑战，生物催化可提供更温和的条件（低温、常压、无有害溶剂和金属），且可实现一步一锅反应。已有多种酶法用于胺化反应，如氨基酸脱氢酶（AADHs）、胺还原酶（AmDHs）和还原胺化酶（RedAm）。其中，胺转氨酶（ATAs）可利用辅因子磷酸吡哆醛（PLP）和胺供体（如丙氨酸或单异丙胺MIPA）将酮或醛转化为相应胺。Pintor等人曾报道六种转氨酶在25?mm HMF下实现>99%转化，但提高HMF至200?mm时转化率仅50%–70%。研究人员前期工作使用可溶性和固定化的四种转氨酶，其中来自Silicibacter pomeroyi的SpATA最有效，但仅应用于低浓度（13?mm HMF）的连续流反应，转化率100%。因此，本研究旨在系统评估SpATA催化HMF转氨生成HMFA的反应，并优化条件以实现放大合成。

**主要技术方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：1）使用戊二醛功能化的HA-beads（HAGA-beads）对SpATA进行共价固定化，获得可重复使用的固定化酶催化剂；2）利用SpinChem旋转床反应器（RBR）进行放大反应（200?mL规模），该反应器可改善传质并简化固定化酶的分离与重复使用；3）通过紫外分光光度法（283?nm）连续监测HMF浓度变化以计算转化率；4）采用核磁共振（NMR）和高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）确认产物HMFA的结构。所有样本均来自实验室构建的SpATA表达体系，未涉及特定患者队列。

**研究结果**

**2 Results and Discussion**

**酶稳定性分析**：首先考察了固定化SpATA在不同温度下的储存稳定性和重复使用稳定性。储存稳定性实验显示，在22?°C以上温度时，酶活性迅速下降（如30–37?°C仅2天后残余活性<55%），这与前期连续流反应中12天后转化率降至约40%的现象一致。重复使用稳定性实验表明，在20?h内（10个循环），SpATA在4–37?°C均可保持活性，但长时间操作后活性损失明显。因此，高温虽提高初始反应速率，但加速酶失活，需在短时间内实现高转化率。

**2.1 优化酶法HMFA生产**

**胺供体过量优化**：使用可溶性SpATA（0.335?mg/mL）在0.4?mm HMF下，分别以L-丙氨酸和MIPA为胺供体，在22?°C、30?°C和37?°C下测试1倍至100倍过量。结果表明，使用L-丙氨酸时，转化率随过量增加而显著提高（30?°C下1倍过量仅29%，100倍过量达90%），而MIPA在低过量（2.5倍）时即可达到>90%转化率，且继续增加过量提升有限。MIPA的初始活性在50倍过量时达到平台，而L-丙氨酸的活性持续增加至100倍。因此，MIPA是更优的胺供体，5倍过量可在1?h内实现>90%转化，兼顾原子经济性。

**底物浓度升高**：将HMF浓度从0.4?mm逐步提高至900?mm，使用5倍MIPA过量，发现所有浓度下24?h后转化率均>95%，未观察到底物抑制。但浓度高于150?mm时出现棕色沉淀，经NMR分析确认是HMF与MIPA在碱性条件下形成亚胺。参考实验表明，沉淀仅出现在高浓度HMF+MIPA体系，且不影响HMF在245?nm的吸光度变化。因此，为免沉淀干扰，后续实验使用≤150?mm HMF。

**固定化酶用量优化**：在2?mm HMF和25倍MIPA过量下，比较5–35?mg固定化酶（HAGA-beads）的催化效果。结果显示，10?mg以上即可在1?h内实现完全转化，但单位质量珠的初始活性在5–10?mg较高，15?mg后基本稳定。因此，7.5?mg/mL的珠量是高效且经济的比例。

**高通量验证**：在100?mm和150?mm HMF下，使用10–20?mg固定化酶（2?mL反应体积），发现15?mg（即7.5?mg/mL）可在24?h内达到>97%转化，与之前的优化结果一致。

**2.2 小规模分批实验的放大转化**

比较2?mL、20?mL和200?mL规模下的反应，条件相同（100?mm HMF、5倍MIPA、7.5?mg/mL固定化酶、37?°C）。2?mL和20?mL反应在120?h内完全转化，200?mL反应在SpinChem RBR中于48?h内达到93%转化，产率一致，证明该反应可高效放大。

**重复使用性**：在200?mL SpinChem RBR中每48?h更换反应液，进行五个循环。转化率从第一循环的93%逐步下降至第五循环的约20%，表明酶在长期操作中失活，与储存稳定性数据一致。五个循环共消耗12.6?g HMF，总转化率55.9%，获得7.04?g HMFA，其中第一循环生产2.34?g。产物经提取后通过HPLC-MS、GC和NMR确认为HMFA。

**讨论与结论**

本研究系统优化了SpATA催化HMF转氨生成HMFA的过程。关键发现包括：MIPA作为胺供体远优于L-丙氨酸，仅需2.5–5倍过量即可在短时间内获得>95%转化率；SpATA对高浓度HMF（最高900?mm）无抑制，但>150?mm时因亚胺生成导致沉淀，故实际适用浓度≤150?mm；固定化SpATA可在2?mL至200?mL规模下有效放大，采用SpinChem旋转床反应器实现了多循环生产，尽管酶活性随循环次数下降，但最终成功合成了超过7?g HMFA。该研究验证了转氨酶在生物基平台化合物胺化中的放大可行性，为绿色合成药物中间体提供了高效路径。

**研究结论部分翻译**：在本研究中，研究人员分析并优化了SpATA催化的HMF转氨生成HMFA过程，以实现更高的底物和产物负载。一个关键方面是胺供体过量的重要性：仅需2.5–5倍MIPA过量即可在短时间内获得>95%转化率，而使用L-丙氨酸则需要>50倍过量才能达到>80%转化率，这清楚地表明了为转氨酶精心选择胺供体的重要性。随后，研究了底物浓度，并在高达900?mm HMF下进行了反应。尽管在所有测试浓度下均成功实现了95%的转化率，但浓度高于150?mm时观察到沉淀，这归因于碱性条件下HMF与胺供体之间的亚胺形成。最后，固定化SpATA被用于100?mm和150?mm HMF的反应，几乎完全转化，证明了可溶性和固定化转氨酶用于HMF转氨的适用性。2?mL、20?mL和200?mL规模的反应表现同样良好，揭示了该反应的可放大性，其中200?mL反应在SpinChem旋转床反应器中进行。尽管SpATA的活性随着重复使用次数的增加而下降，但成功合成了超过7?g HMFA。