《Journal of Functional Foods》：Bischofia javanica as a functional food source: Integrated DNA barcoding and metabolomics reveal multi-target regulation of anti-allergic, anti-inflammatory, and osteogenic activities
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Bischofia javanica叶传统上作为蔬菜食用并用于炎症及骨骼相关疾病，但其生物活性化合物仍缺乏充分表征。本研究旨在鉴定生物活性酚类化合物并评估其功能潜力。植物身份通过DNA条形码确认。利用UHPLC-Orbitrap-MS/MS结合GNPS辅助注释
Bischofia javanica叶传统上作为蔬菜食用并用于炎症及骨骼相关疾病，但其生物活性化合物仍缺乏充分表征。本研究旨在鉴定生物活性酚类化合物并评估其功能潜力。植物身份通过DNA条形码确认。利用UHPLC-Orbitrap-MS/MS结合GNPS辅助注释进行化学谱图分析与定量，鉴定出主要酚类物质包括没食子酸甲酯、柯里拉京、老鹳草素、没食子酸、鞣花酸及牡荆素，并首次报道在B. javanica中检测到4-羟基苯甲酸和水杨酸。体外生物测定显示显著抗炎及骨骼相关活性，其中没食子酸甲酯表现出77.82%的NF-κB抑制率与71.03%的TRAP抑制率；柯里拉京显示65.07%的NF-κB抑制率与48.06%的碱性磷酸酶（ALP）刺激率；老鹳草素显示49.85%的NF-κB抑制率与63.64%的ALP刺激率。分子对接与动力学模拟证实活性化合物与目标蛋白的稳定结合。这些发现为B. javanica叶的传统用途提供了科学支持，并表明其可能是具有体外抗炎及骨骼相关生物活性的酚类化合物来源。然而，本发现基于体外与计算方法，仍需涉及食品级提取、生物可及性、生物利用度、安全性及体内研究的进一步工作来验证这些发现并评估其作为功能性食物或营养保健成分的前景。
该研究发表于《Journal of Functional Foods》。近年来，植物来源的治疗药物与功能性食物因相较于常规对抗疗法药物具有更高的感知安全性与更少的不良反应而受到日益关注，植物药在全球多种文化中广泛应用并在慢性疾病管理中持续受到重视。Bischofia javanica Blume属于叶下珠科，广泛分布于澳大利亚、中国、印度、印度尼西亚、日本、马来西亚、缅甸、菲律宾、台湾、泰国、太平洋岛屿及越南等地，其叶、嫩枝与果实在亚洲多地传统上作为日常饮食中的食物与药物使用，如在印尼北苏门答腊的Karo族用于制作terites，在台湾用于炖鸡汤即茄苳鸡，其根与树皮浸液传统上用于强筋骨与缓解关节痛，果实泡酒作为滋补品茄苳酒。尽管已有报道指出B. javanica叶与树皮具有抗过敏、抗癌、抗糖尿病、抗腹泻、抗炎、抗白血病、抗微生物、镇痛、抗氧化、镇咳、驱虫及抗线虫等多种生物活性，并含有生物碱、苷类、黄酮类、酚类、鞣质、甾体及三萜类等植物化学成分，但其叶片的酚类与植物化学组成仍缺乏充分表征，关于其潜在抗过敏、抗炎及骨骼相关生物活性的信息亦有限。过敏是对过敏原的不良免疫反应，常伴随继发性炎症反应，慢性过敏疾病与系统性免疫失调相关，涉及免疫球蛋白E（IgE）与肥大细胞活化释放促炎介质，IgE与肥大细胞及嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fc ε受体I（FcεRI）结合，交联后触发炎症介质释放，其中Src家族激酶（SFKs）如Lyn通过激活脾酪氨酸激酶（Syk）启动下游信号导致钙释放与蛋白激酶C（PKC）激活及肥大细胞脱颗粒，常以RBL-2H3细胞中β-己糖胺酶释放为标志物评估。炎症涉及巨噬细胞等免疫细胞激活释放一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及环氧化酶-2（COX-2）等促炎介质，核因子-κB（NF-κB）驱动诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等转录，NO产生与NF-κB转录活性分别以Griess试剂与荧光素酶报告基因检测评估。骨重塑由破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成维持平衡，慢性炎症通过增强破骨细胞活性与抑制成骨细胞功能破坏平衡导致骨质流失，组胺可增加破骨细胞形成，促炎细胞因子如TNF-α与白细胞介素-34（IL-34）协同受体激活核因子-κB配体（RANKL）促进破骨细胞过度激活，破骨细胞释放抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）为分化标志，成骨细胞分化则以碱性磷酸酶（ALP）为可靠标志在MC3T3-E1细胞中评估。为填补上述知识空白，研究人员对B. javanica进行DNA条形码认证，利用UHPLC-Orbitrap-MS/MS谱图结合GNPS辅助注释与主要酚类化合物定量分析表征甲醇分配馏分的植物化学轮廓，通过细胞实验评估抗过敏、抗炎及骨骼相关活性，并进行分子对接与分子动力学模拟探索化合物与靶点的相互作用，首次在该物种中鉴定4-羟基苯甲酸与水杨酸。
研究人员采用的关键技术方法包括：于台湾旗山区采集Bischofia javanica叶片样本并进行DNA条形码鉴定，利用ITS2序列进行BLAST比对与二级结构预测以确认物种；通过溶剂分配获得BJ-M（75%甲醇分配层）馏分；采用GNPS平台基于特征分子网络（FBMN）进行代谢组学注释并结合UHPLC-Orbitrap-MS/MS定性定量主要酚类；使用RBL-2H3、RAW 264.7、HEK-293T及MC3T3-E1细胞系分别通过β-己糖胺酶释放、NO产生与NF-κB荧光素酶报告、TRAP活性及ALP活性检测评估生物活性；采用AutoDockTools进行分子对接靶向SYK、iNOS、NF-κB、ACVR1与RANKL，并利用100 ns分子动力学模拟评估蛋白-配体复合物稳定性；通过SwissADME与pkCSM预测化合物的类药性（Lipinski五规则）与ADMET性质。
3.1. DNA barcoding
研究人员对Bischofia javanica样本进行核内转录间隔区2（ITS2）序列分析，BLAST比对显示与GenBank登录号KR531877的B. javanica序列最高得分409且100%一致，与KR531846一致性98.22%，确认样本归属。预测的ITS2二级结构呈典型四螺旋模型（螺旋I–IV），其中螺旋III最长含内部环与凸环，螺旋I与II较短为简单茎环，螺旋IV为伸长茎环，其螺旋、环、凸与配对区配置提供物种特异性结构证据。
3.2. GNPS molecular network construction
研究人员对BJ-M馏分进行GNPS分子网络分析，获得590个节点组织为86个分子家族，涵盖氨基酸、苯及其衍生物、苯并吡喃、羧酸衍生物、肉桂酸衍生物、黄酮类、脂肪酸、甾体、鞣质等。网络中注释出肉桂酸衍生物如甲基4-羟基肉桂酸酯与阿魏酸，苯衍生物如5-甲氧基水杨酸、3-甲基水杨酸、没食子酸丙酯等及鞣质如柯里拉京、鞣花酸、老鹳草素、pedunculagin与黄酮类如异牡荆素与牡荆素，多数节点未注释提示可能存在新颖或未被充分表征的代谢物。
3.3. UHPLC characterization of BJ 75% MeOH (BJ-M)
研究人员通过LC-MS在BJ-M色谱图中识别8个主要峰并对照标准品鉴定定量，含量以mg/g BJ-M计分别为牡荆素31.83 ± 1.64、老鹳草素22.95 ± 2.69、没食子酸11.04 ± 1.60、鞣花酸9.67 ± 1.00、柯里拉京6.50 ± 0.83、4-羟基苯甲酸1.23 ± 0.17、没食子酸甲酯0.97 ± 0.27、水杨酸0.12 ± 0.01，其中牡荆素与老鹳草素为主要成分，4-羟基苯甲酸与水杨酸为首次在该物种中检出。
3.4. In vitro assessment of anti-allergic activity
研究人员在RBL-2H3细胞中以A23187与抗原（IgE + DNP-BSA）诱导脱颗粒评估BJ-M与化合物，MTT确认浓度下细胞活力超80%。BJ-M在200 μg/mL抑制β-己糖胺酶释放41.46%；没食子酸甲酯200 μM在A23187与抗原模型中分别抑制63.17%与47.26%；柯里拉京200 μM分别为41.52%与59.37%；老鹳草素200 μM分别为35.38%与41.37%，其他化合物抑制率5–35%，均呈浓度依赖性。
3.5. In vitro assessment of anti-inflammatory activity
研究人员在RAW 264.7与HEK-293T细胞中评估LPS诱导NO产生与TNF-α诱导NF-κB激活，无细胞毒性。BJ-M在100 μg/mL抑制亚硝酸盐79.89%与NF-κB 69.34%。没食子酸甲酯抑制亚硝酸盐83.20%与NF-κB 77.82%；鞣花酸、柯里拉京、没食子酸、老鹳草素抑制亚硝酸盐分别为29.20%、23.72%、21.26%、49.17%，抑制NF-κB分别为80.83%、65.07%、75.28%、49.85%，均呈剂量依赖。
3.6. Bone remodeling assays
研究人员通过RAW264.7细胞TRAP活性与MC3T3-E1细胞ALP活性评估骨重塑，选前述活跃化合物（排除水杨酸与牡荆素）。TRAP实验中没食子酸甲酯10与5 μM分别抑制至对照组71.03%与57.94%，鞣花酸20 μM抑制49.03%，没食子酸80 μM抑制44.97%，柯里拉京5 μM抑制10.32%，老鹳草素10 μM抑制27.29%，BJ-M在10 μg/mL抑制42.26%；ALP实验中柯里拉京10 μM增加48.06%，老鹳草素10 μM增加63.64%，4-羟基苯甲酸80 μM增加18.90%，BJ-M 20与10 μg/mL分别增加33.99%与27.02%，没食子酸与没食子酸甲酯降低ALP活性。表明没食子酸甲酯主要抑制破骨细胞生成，柯里拉京与老鹳草素促进成骨细胞分化。
3.7. Molecular docking
研究人员对全部化合物对接SYK（4PV0）、iNOS（3E7G）、NF-κB（8TQD）、RANKL（5TDI）与ACVR1（3H9R）。重点展示没食子酸甲酯、柯里拉京、老鹳草素：老鹳草素对SYK结合能-10.50 kcal/mol，柯里拉京-8.70 kcal/mol，没食子酸甲酯-5.44 kcal/mol；对iNOS柯里拉京-10.43 kcal/mol，老鹳草素-9.56 kcal/mol，没食子酸甲酯-6.75 kcal/mol；对NF-κB柯里拉京-8.12 kcal/mol，老鹳草素-5.93 kcal/mol，没食子酸甲酯-5.75 kcal/mol；对RANKL老鹳草素-11.40 kcal/mol，柯里拉京-8.99 kcal/mol，没食子酸甲酯-6.67 kcal/mol；对ACVR1牡荆素最高，柯里拉京-7.97 kcal/mol结合Glu113等，老鹳草素-4.45 kcal/mol。没食子酸甲酯对接中等但体外抑制NO、NF-κB与TRAP更强，反映对接局限。
3.8. Molecular dynamics
研究人员对8TQD、5TDI、3H9R复合物进行100 ns分子动力学模拟。PL-RMSD显示所有复合物约40 ns后稳定，平均PL-RMSD如8TQD-没食子酸甲酯0.240 ?、8TQD-柯里拉京1.070 ?、8TQD-老鹳草素1.655 ?、5TDI-没食子酸甲酯0.212 ?、3H9R-柯里拉京1.089 ?等，均低于3 ?表明骨架稳定。平均P-RMSF如8TQD-没食子酸甲酯3.421 ?、8TQD-柯里拉京1.136 ?、5TDI-没食子酸甲酯0.747 ?、3H9R-柯里拉京1.031 ?等。接触分析显示各靶点关键残基如8TQD的Val21、Cys22、His104等，5TDI的Gly64、Gly66、Tyr67、Met68，3H9R的Glu41、Cys42、Tyr111、His112、Glu113、Asp119等在配体中稳定相互作用，轨迹构象偏差低于2 ?。
3.9. Pharmacokinetic and ADMET analysis
研究人员按Lipinski五规则评估，没食子酸、4-羟基苯甲酸、没食子酸甲酯、水杨酸、鞣花酸符合规则；柯里拉京与老鹳草素因分子量高与氢键供受体多部分违反；牡荆素轻微偏离。ADMET预测4-羟基苯甲酸、没食子酸甲酯、水杨酸、鞣花酸肠道吸收>75%，没食子酸、柯里拉京、牡荆素中等>43%；所有化合物血脑屏障渗透低，不作用细胞色素P450酶。
讨论部分总结：研究人员指出既往B. javanica研究多依赖定性谱图，本研究定量突出牡荆素与老鹳草素为BJ-M主要成分并首次报道4-羟基苯甲酸与水杨酸，GNPS网络与UHPLC结果一致且存在未注释节点提示新颖代谢物。抗过敏抗炎结果显示没食子酸甲酯、柯里拉京、老鹳草素抑制肥大细胞脱颗粒与NO及NF-κB，与文献一致且老鹳草素抗过敏为首次报道。骨重塑中没食子酸甲酯抑破骨细胞，柯里拉京与老鹳草素促成骨细胞，与既往体内外机制相符，活性不依丰度而与内在效力及协同有关。分子对接显示老鹳草素与柯里拉京亲和高但没食子酸甲酯体外强，反映对接局限；分子动力学证实100 ns内复合物稳定。ADMET预测低血脑屏障渗透与低CYP作用提示低中枢穿透与药物相互作用风险。结构活性关系指出高分子鞣质结合强但通透可能受限，小分子没食子酸甲酯细胞可及性高。研究局限在于主要为体外与计算，未测IC50，BJ-M非食品级提取且未体内验证，需后续评估生物可及性、安全性与体内效价。
结论部分翻译：本研究对Bischofia javanica叶在炎症、过敏反应及骨重塑方面的生物活性潜力进行了全面调查。尽管既往研究强调B. javanica提取物的药理潜力，但许多未能鉴定或定量负责所观察活性的特定植物化学成分。相比之下，本研究不仅证明粗提取物的生物活性，还鉴定并定量其主要成分并评估其生物活性。利用UHPLC-Orbitrap-MS/MS进行化学谱图分析与定量，辅以GNPS分子网络支持的化合物注释揭示了多样的植物化学成分。据研究所知，本研究首次报道在B. javanica中存在4-羟基苯甲酸与水杨酸，并首次利用UHPLC-Orbitrap-MS/MS对甲醇分配馏分中的成分进行定量分析。在鉴定化合物中，没食子酸甲酯、柯里拉京与老鹳草素表现出强抗过敏与抗炎活性，并通过调节破骨细胞与成骨细胞分化影响骨重塑。此外，分子对接与分子动力学分析支持这些化合物与涉及过敏、炎症及骨代谢的关键分子靶点的稳定结合相互作用。总之，这些结果表明B. javanica含有具有前景的体外抗过敏、抗炎及骨骼相关生物活性的酚类化合物，并得到分子对接与分子动力学分析的支持。这些发现为B. javanica的传统用途提供了科学支持并奠定基础以供进一步研究。然而，仍需涉及食品级提取物、生物利用度评估、体内验证与安全性评价的进一步研究来确认其作为功能性食物或营养保健成分的潜在应用。
