《Journal of Functional Foods》：Immune regulatory functions and underlying mechanisms of porcine skin collagen peptides prepared by ultrasound
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本研究通过超声波辅助水解（400 W，30 min）优化了具有免疫调节活性的猪皮明胶肽（PSPs）的制备。超声波处理破坏了蛋白质结构，促进了低分子量肽的生成，从而增强了其抗炎和抗氧化活性。在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞中，PSPs（< 3 k
本研究通过超声波辅助水解（400 W，30 min）优化了具有免疫调节活性的猪皮明胶肽（PSPs）的制备。超声波处理破坏了蛋白质结构，促进了低分子量肽的生成，从而增强了其抗炎和抗氧化活性。在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞中，PSPs（< 3 kDa）在1–50 μg/mL浓度范围内未表现出细胞毒性，同时有效促进了细胞吞噬作用并抑制了过度的炎性细胞因子分泌。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定了290个肽序列，通过生物信息学筛选优先考虑了六个具有高免疫调节潜力的序列。随后的机制研究表明，新型肽FLPEPPQE表现出强大的免疫调节作用，主要通过调节与Toll样受体4（TLR4）/髓样分化初级反应88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）信号通路相关的蛋白介导。总之，这些结果系统地阐明了PSPs的制备方法和体外免疫调节机制，为猪副产物的高值化利用提供了初步的理论支持。
**论文解读：超声波辅助制备猪皮胶原蛋白肽的免疫调节功能及机制研究**
**研究背景与意义**
免疫系统是维持机体稳态、抵御病原体入侵和清除异常细胞的关键生理防御体系。目前临床使用的合成免疫调节剂（如他克莫司、环磷酰胺、地塞米松）虽有效，但存在成本高、耐药性和副作用等问题。因此，天然来源的免疫调节剂因其高安全性、易获取性和生物相容性而备受关注。生物活性肽，特别是免疫调节肽，能维持免疫稳态、增强防御或抑制过度免疫反应。猪皮占活猪体重约5%，是肉类加工的主要副产物，富含胶原蛋白，是制备胶原源生物活性肽的优质原料。然而，传统酶解法制备肽存在水解效率低、反应时间长、产率不足等问题。超声波辅助酶解技术通过空化效应和剪切力破坏蛋白质结构，暴露酶切位点，提高水解效率。但现有研究多集中于肽产率和抗氧化活性，缺乏对免疫调节功能的系统研究。因此，本研究旨在通过超声波辅助酶解从猪皮中制备免疫调节肽，建立涵盖工艺优化、活性评价、肽筛选和机制验证的整合研究范式，为猪副产物高值化利用提供理论依据。该论文发表在《Journal of Functional Foods》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用超声波辅助碱性蛋白酶水解工艺，从猪皮明胶中制备肽段（PSPs）。关键技术包括：超声波预处理（400 W，30 min）优化酶解效率；圆二色谱（CD）分析二级结构；超滤获得< 3 kDa组分；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定肽序列；利用生物信息学工具（PreTP-Stack、AIPpred、ToxinPred）筛选免疫调节肽；化学合成候选肽并验证其活性；通过Western blot检测TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表达。
**研究结果**
**3.1 超声波辅助酶解工艺的优化**
**3.1.1 相对肽含量**
研究显示，超声波预处理显著提高肽产率。在400 W、30 min条件下，相对肽含量达87.95%，但延长至45 min时无显著差异，归因于高功率空化气泡的屏蔽效应。
**3.1.2 抗氧化能力**
ABTS
+和DPPH自由基清除率在400 W、30 min时达峰值（82.46%和44.72%），但45 min时下降，因过度超声可能氧化关键氨基酸残基（酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸）。
**3.1.3 抗炎活性**
超声波预处理显著增强PSPs抑制牛血清白蛋白（BSA）变性和一氧化氮（NO）产生的能力，在400 W、30 min时BSA变性抑制率达20.00%，在300 W、30 min时NO抑制率达20.85%。
**3.1.4 二级结构**
圆二色谱（CD）显示，超声波处理导致α-螺旋和β-折叠含量降低，β-转角和无规卷曲含量增加，表明空化作用破坏氢键网络，使肽链展开，暴露疏水活性域，增强免疫受体结合力。
**3.2 PSPs对RAW264.7细胞的毒性评估**
在1–50 μg/mL浓度范围内，PSPs无细胞毒性，且50 μg/mL时细胞活力达123.53%，促进细胞增殖。
**3.3 PSPs对吞噬能力和NO分泌的影响**
PSPs（5–100 μg/mL）显著增强吞噬活性，50 μg/mL时达峰值147%；同时抑制NO生成，50 μg/mL时抑制率达65.52%。
**3.4 PSPs对炎性细胞因子分泌和mRNA表达的影响**
PSPs浓度依赖性抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6分泌（50 μg/mL时抑制率分别为24.05%和40.89%），并降低IL-1β、IL-8、TNF-α和IL-6的mRNA表达，其中IL-6 mRNA抑制率达74.41%。
**3.5 PSPs中的肽序列**
LC-MS/MS鉴定出290个高置信度肽序列，88.62%分子量<800 Da，87.4%为四肽至六肽。N端以苯丙氨酸（Phe）为主（25%），C端以亮氨酸（Leu）为主（36%）。
**3.6 肽序列筛选**
通过PreTP-Stack和AIPpred预测，筛选出六个无毒性、源自胶原蛋白的候选肽：FKMPEM、DFGYER、FRVPSY、FLPEPPQE、PGER、PLLK。
**3.7 合成肽对吞噬活性和NO产生的影响**
在50 μg/mL浓度下，所有合成肽无细胞毒性。PG-4显著增强吞噬活性（148.5%），FL-8和PG-4显著抑制NO产生（28.0%和24.4%）。
**3.8 合成肽对炎性细胞因子的影响**
DF-6和FL-8显著抑制TNF-α mRNA表达（27.5%和24.3%），FL-8显著抑制IL-6 mRNA表达（44.5%）。ELISA显示FR-6、PL-4和FL-8抑制TNF-α分泌（约31.6%），FK-6和FL-8抑制IL-6分泌（19.2%和16.7%）。FL-8表现出最强免疫调节活性，归因于其高脯氨酸含量形成的聚脯氨酸II（PPII）螺旋结构，增强稳定性和细胞摄取。
**3.9 FLPEPPQE对RAW264.7细胞NF-κB通路的影响**
Western blot显示，FL-8显著下调LPS诱导的iNOS和COX-2蛋白表达（分别降低9.4%和13.4%），降低TLR4和MyD88蛋白水平，抑制IκBα磷酸化和p65磷酸化，从而阻断NF-κB通路激活。这表明FL-8通过调节TLR4/MyD88依赖的NF-κB信号通路发挥免疫调节作用。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，FL-8的免疫调节机制与已知的免疫调节肽（如厚壳贻贝肽和KPV三肽）一致，通过靶向TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制炎症。但结论仅基于体外RAW264.7细胞模型，需进一步体内动物实验验证。
**研究结论**：本研究采用碱性蛋白酶酶解猪皮，并在酶解前进行超声波预处理。结果表明，在400 W、30 min超声波条件下制备的PSPs免疫调节活性显著增强。在RAW264.7细胞中，PSPs（< 3 kDa）无细胞毒性，显著提高细胞吞噬活性，并抑制炎性因子分泌。基于PreTP-Stack、AIPpred和ToxinPred的生物信息学筛选，选取六个潜在免疫调节肽并化学合成。序列FL-8通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表现出优越的免疫调节作用。总体而言，本研究为PSPs作为免疫调节剂的应用提供了理论基础。
