《Journal of Functional Foods》：Actinidia arguta fruit extract attenuates osteoarthritis progression by suppressing inflammation and subchondral bone osteoclastogenesis
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骨关节炎（OA）是一种由慢性炎症、软骨破坏和异常软骨下骨重塑驱动的退行性关节疾病。软骨下骨重塑在OA进展中起关键作用。本研究调查了软枣猕猴桃果实提取物（KFE）对OA的保护作用并探讨了其潜在机制。在体外，KFE通过降低一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF
骨关节炎（OA）是一种由慢性炎症、软骨破坏和异常软骨下骨重塑驱动的退行性关节疾病。软骨下骨重塑在OA进展中起关键作用。本研究调查了软枣猕猴桃果实提取物（KFE）对OA的保护作用并探讨了其潜在机制。在体外，KFE通过降低一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，显著减弱了巨噬细胞中的炎症反应。此外，KFE通过抑制核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，抑制了关键破骨细胞生成调控因子，从而阻断了核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞分化，且未明显损害成骨分化。在体内，KFE给药缓解了疼痛相关行为，改善了软骨下骨微结构，并减轻了组织病理学关节损伤。这些发现表明，KFE通过抑制炎症和破骨细胞介导的软骨下骨重塑来延缓OA进展，凸显了其作为功能性食品成分用于OA预防和管理的潜力。
**论文解读**
**1. 研究背景与问题**
骨关节炎（OA）是一种以关节软骨进行性退变、软骨下骨重塑和滑膜炎症为特征的慢性退行性关节疾病，是导致中老年人群关节疼痛和功能障碍的主要原因之一。随着人口老龄化和肥胖等风险因素增加，OA的发病率持续上升，构成了重大的全球公共卫生负担。越来越多的证据表明，OA本质上是一种全关节疾病，其中软骨下骨在疾病的起始和进展中扮演着关键角色。成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞（osteoclast）介导的骨吸收之间的平衡被打破，导致了异常的软骨下骨重塑。尤其是，破骨细胞活性增强介导的骨吸收过度增加，是软骨下骨结构改变的关键驱动因素。在核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞生成过程中，核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等经典信号通路被激活，进而诱导c-Fos和活化T细胞核因子c1（NFATc1）等关键转录因子的表达和核转位，最终驱动破骨细胞分化和功能活化。因此，靶向破骨细胞分化及其相关信号通路已成为延缓OA进展的潜在治疗策略。
目前，OA的临床治疗主要依赖非甾体抗炎药（NSAIDs）和糖皮质激素，这些药物虽能有效缓解疼痛和炎症，但无法阻止疾病进展，且长期使用会带来胃肠道损伤和心血管风险增加等副作用。在此背景下，开发安全、天然的功能性食品和生物活性化合物作为OA预防和管理的补充策略，受到了越来越多的关注。软枣猕猴桃（*Actinidia arguta*）果实富含酚酸、黄酮类、维生素C和多糖等多种生物活性成分，其多酚成分具有抗氧化和抗炎活性。然而，软枣猕猴桃果实提取物（KFE）是否具有通过调节破骨细胞生成和软骨下骨重塑来延缓OA进程的保护作用，其潜在机制尚不明确。因此，研究人员开展了此项研究，旨在系统评估KFE对炎症反应和破骨细胞分化的影响，并阐明其分子机制。该论文发表在《Journal of Functional Foods》。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员采用了以下主要技术方法：首先，使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技术对KFE的化学成分进行定性表征。在体外，分别建立了脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型和RANKL诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs）破骨细胞分化模型，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光染色、酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）染色和蛋白质免疫印迹（Western blotting）等技术评估KFE的抗炎和抗破骨细胞生成作用。在体内，采用碘乙酸单钠（MIA）诱导的Sprague-Dawley（SD）大鼠骨关节炎（OA）模型（来源：Koatech Inc.，韩国），通过口服给药KFE 4周，利用行为学评估（von Frey丝和热板法）、显微计算机断层扫描（micro-CT）、组织病理学分析（苏木精-伊红（H&E）和番红O/固绿（SO/FG）染色、TRAP染色、免疫组化）及血清生化分析等方法评估KFE的体内保护作用。
**3. 研究结果**
**3.1. KFE的化学成分鉴定**
通过UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析，在KFE中初步鉴定出13种主要化合物，包括有机酸、氨基酸、核苷、酚酸相关化合物和黄酮类化合物。KFE的总酚含量（TPC）为26.38 mg GAE/g，总黄酮含量（TFC）为1.41 mg QE/g，表明非黄酮类酚类成分是其主要酚类成分。靶向高效液相色谱（HPLC）定量分析显示，KFE中绿原酸含量为46.6 μg/g。
**3.2. KFE减弱LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症**
通过建立LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，研究发现KFE处理能显著逆转LPS引起的细胞形态学改变（如细胞增大、伪足增多）。KFE剂量依赖性地显著降低了LPS刺激后培养上清中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平。蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析显示，KFE有效抑制了LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的表达，但对Toll样受体4（TLR4）和髓样分化因子88（MyD88）的表达无显著影响。
**3.3. KFE抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中NF-κB和MAPK的激活**
研究发现，KFE处理剂量依赖性地降低了LPS诱导的IκBα和NF-κB p65的磷酸化水平，并显著抑制了NF-κB p65的核转位。同时，KFE也显著抑制了LPS诱导的细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun N端激酶1/2（JNK1/2）和p38 MAPK的磷酸化。这表明KFE通过抑制NF-κB和MAPK信号通路发挥抗炎作用。
**3.4. KFE抑制RANKL诱导的BMMs破骨细胞分化**
在原代BMMs中，RANKL刺激显著促进了TRAP阳性多核破骨细胞的形成。KFE处理剂量依赖性地减少了破骨细胞的数量和面积。通过不同时间窗口的处理发现，KFE在早期（D1-D3）的抑制作用强于晚期（D5-D6），提示其主要靶向破骨细胞分化的早期阶段。此外，KFE显著降低了脂多糖（LPS）/RANKL共刺激下BMMs中TNF-α和IL-1β的水平。蛋白质免疫印迹（Western blotting）结果显示，KFE显著抑制了RANKL诱导的RANK、TRAF6、c-Fos、NFATc1、基质金属蛋白酶9（MMP9）和组织蛋白酶K（Cathepsin K）的表达。
**3.5. KFE抑制破骨细胞分化过程中的NF-κB和MAPK信号通路及NFATc1核转位**
免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析表明，KFE处理显著抑制了RANKL诱导的NFATc1核转位，并降低了细胞核中NF-κB p65、c-Fos和NFATc1的水平。同时，KFE也显著抑制了RANKL诱导的IκBα、NF-κB p65、ERK1/2、JNK1/2和p38 MAPK的磷酸化。
**3.6. KFE对BMSCs的成骨分化无显著影响**
在骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，KFE处理（25-200 μg/mL）对细胞活力无显著影响。在成骨诱导条件下，KFE处理未显著影响碱性磷酸酶（ALP）活性、矿化结节形成以及成骨标志物（RUNX2、COL1A1、OCN）的表达。这表明KFE选择性抑制破骨细胞生成，而不影响成骨分化。
**3.7. KFE改善MIA诱导的骨关节炎进展**
在MIA诱导的OA大鼠模型中，KFE给药（尤其是高剂量组）减轻了关节结构破坏，表现为软骨表面相对完整、软骨下骨微结构改善。KFE高剂量组显著降低了MIA引起的膝关节直径增加，并改善了机械性痛觉阈值和热痛觉潜伏期。显微CT（micro-CT）定量分析显示，KFE高剂量组显著增加了骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）。血清学分析表明，KFE高剂量组降低了MIA升高的前列腺素E2（PGE2）和TNF-α水平，并提高了超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低了丙二醛（MDA）水平。组织病理学检查未观察到KFE对主要器官的明显毒性。
**3.8. KFE减轻OA大鼠关节组织的组织病理学损伤**
苏木精-伊红（H&E）和番红O/固绿（SO/FG）染色显示，KFE给药减轻了MIA诱导的关节软骨结构损伤、软骨细胞丢失和蛋白聚糖降解。组织学评分（OARSI评分和滑膜炎评分）在KFE高剂量组中显著降低。TRAP染色和免疫组化分析显示，KFE高剂量组显著减少了软骨下骨区域TRAP阳性细胞和组织蛋白酶K（Cathepsin K）阳性细胞的数量。
**3.9. KFE抑制OA大鼠关节组织中的炎症和破骨细胞生成**
对OA大鼠膝关节软骨下骨组织的蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析显示，KFE高剂量组显著抑制了MIA诱导的炎症介质（COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达。同时，KFE高剂量组也显著抑制了破骨细胞相关蛋白（TRAP、MMP9、Cathepsin K、RANK、TRAF6、c-Fos、NFATc1）的表达，以及IκBα、NF-κB p65、ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化水平。
**4. 讨论与结论**
**讨论部分总结：** 本研究表明，KFE能够通过调节NF-κB和MAPK信号通路，抑制炎症反应和破骨细胞介导的软骨下骨重塑，从而延缓OA进展。KFE的抗炎作用体现在抑制巨噬细胞中NO、TNF-α和IL-1β的产生，这与NF-κB p65核转位和MAPK磷酸化的抑制有关。KFE的抗破骨细胞生成作用主要通过抑制NF-κB/MAPK-c-Fos/NFATc1轴，靶向破骨细胞分化的早期阶段来实现。值得注意的是，KFE对成骨分化无显著影响，这表明其可能通过选择性抑制骨吸收来维持骨代谢稳态。在MIA诱导的OA大鼠模型中，KFE不仅缓解了疼痛相关行为，还改善了软骨下骨微结构，减少了组织病理学损伤和破骨细胞活性。从转化医学角度看，KFE来源于可食用水果，且在测试剂量范围内未观察到明显毒性，为其作为功能性食品成分用于OA预防和管理提供了初步的安全性证据。然而，研究也存在局限性，如KFE中具体活性成分的鉴定、口服后生物利用度及关节内有效浓度等问题有待进一步研究。
**结论部分翻译：** 本研究证明，KFE通过调节炎症反应和抑制破骨细胞介导的软骨下骨重塑来延缓OA进展，这与NF-κB和MAPK信号通路的激活减弱有关。这些发现为KFE作为功能性食品成分或膳食补充剂用于OA预防和管理的潜在应用提供了机制支持。尽管目前的研究结果令人鼓舞，但某些方面尚需进一步探究。由于KFE是一种含有多种化学成分的粗提物，其发挥保护作用的特定生物活性化合物仍有待完全鉴定。此外，KFE衍生成分口服给药后的生物利用度和关节内有效浓度仍有待确定。因此，未来的研究需要进行化合物特异性验证、药代动力学分析、长期安全性评估和临床研究，以进一步确认KFE在OA相关应用中的转化潜力。
